Интеллектуальные методы обработки и анализа данных флуоресцентного имиджинга кальциевой активности в астроцитах и мультиспектральных исследований нервной тканиНИР

Next-generation methods of processing and analysis of astrocytic calcium imaging data and multispectral images of nervous tissue

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 18 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. Интеллектуальные методы обработки и анализа данных флуоресцентного имиджинга кальциевой активности в астроцитах и мультиспектральных исследований нервной ткани
Результаты этапа: В отчетном периоде мы сосредоточились на отработке экспрессии комбинированных вирусных конструкций, проведении экспериментов по кальциевому имиджингу in vivo и выявлении пространственно-временных характеристик кальциевой сигнализации астроцитов коры, ассоциированной с локомоторной активностью животного. Накоплен значительный объем экспериментальных данных кальциевого имиджинга на фоне спонтанной локомоции животного на подвижной платформе. Кальциевые ответы охарактеризованы по характерным задержкам относительно момента инициации движения, амплитудам и длительностям ответа, формированию кальциевого ответа как процесса возникновения небольших лидирующих островков активности, сливающихся по мере расширения и постепенно охватывающих значительную часть поля зрения. Экспериментальные данные проанализированы с позиций методов понижения размерности и поиска динамических компонент. Основные характеристики паттернов кальциевых ответов воспроизведены на генеративных моделях, диктуемых данными (DMDc). Реализованы компьютерные симуляции математической модели кальциевой динамики на реалистичных трехмерных пространственных шаблонах. Модельные данные использовались для создания синтетических данных, используемых в отработке методов тензорного разложения для подавления шума и низкоразмерной репрезентации экспериментальных данных. Дополнительно, установлена зависимость частоты и амплитуды астроцитарных кальциевых транзиентов в гиппокампе от расположения точек инициации активности относительно слоя пирамидных нейронов. В ходе выполнения проекта было установлено, что астроциты и нейроны в коре отличаются от соответствующих клеток в гиппокампе повышенным относительным содержанием цитохромов С и В-типов, что говорит об увеличении степени заполнения их ЭТЦ электронами. Мы также показали, что у молодых животных в концевых ножках астроцитов по сравнению с телами астроцитов снижено относительное содержание белков, нормированное на содержание липидов, что может быть связано с морфологией концевых ножек и повышенным содержанием в них мембранных структур. Также в концевых ножках астроцитов выше относительное содержание восстановленных цитохромов С-типа по сравнению с телами астроцитов. При этом у старых животных концевые ножки и тела астроцитов не отличаются, что может свидетельствовать об изменении морфологии ножек и изменении состояния митохондрий. Был отработан подход, основанный на микроспектроскопии КР, для in vivo мониторинга степени оксигенации крови в сосудах коры головного мозга анестезированных животных в условиях нормоксии и при различных воздействиях. В дальнейших экспериментах следующих этапов проекта отработанный подход будет использован для определения локальной оксигенации крови и мониторинга состояния митохондрий (как показателя эффективности потребления О2 и уровня клеточной активности, требующей АТФ) близлежащих астроцитов и нейронов.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Интеллектуальные методы обработки и анализа данных флуоресцентного имиджинга кальциевой активности в астроцитах и мультиспектральных исследований нервной ткани
Результаты этапа: I. Экспериментальные исследования I.1 Кальциевый имиджинг в нейронах Выявлено принципиальное различие между Са2+ ответами нейронов и астроцитов соматосенсорной коры на локомоцию. В отличие от нейронов, астроциты отвечали с задержкой, и их ответ при последующей локомоции снижался. Такая рефрактерность может быть обусловлена различными механизмами, лежащими в основе генерации астроцитарной Ca2+ активности. Ранее разработанные методы анализа кальциевой активности в астроцитах адаптированы для анализа нейрональных данных. I.2 Кальциевая сигнализация в митохондриях астроцитов Обнаружены глобальные воспроизводящиеся повышения концентрации кальция в митохондриях астроцитов, отвечающие на локомоцию животного. Сравнение характеристик митохондриальных кальциевых ответов на локомоцию показало, что медианная задержка (от начала движения до момента времени, когда сигнал ΔF/F в 50% отвечающих пикселей превышает установленный порог) митохондриальных ответов была выше, а пиковые значения относительных изменений флуоресценции ΔF/F ниже, чем в случае цитоплазматической локализации флуоресцентного белка. Тем не менее, пространственные профили времени начала ответа (изохронные карты) были схожи с кальциевыми ответами в цитоплазме астроцитов (рис. 12). I.3 Морфологические характеристики сети митохондрий астроцитов Пространственный профиль флуоресценции GFP с митохондриальной локализацией, в целом, воспроизводит структуру отростков астроцитарного домена и в большинстве случаев остается достаточно стабильным за время регистрации, слабо зависит от локомоции животного. Покадровый анализ демонстрирует тенденцию к повышению ширины филаментов и уменьшению длины скелета филаментов на фоне локомоции. Это может быть связано с изменением четкости изображения во время бега, если сдвиги кадра происходят быстрее, чем регистрируется каждый кадр (с учетом временного биннинга). I.4 4D данные кальциевого имиджинга Таким образом, с помощью LLSM мы смогли обнаружить быстрые спонтанные Ca2+ события в астроцитах которые длятся 70-340 мс. Увеличение внеклеточной концентрации Ca2+ увеличивало частоту, размер и длительность кальциевых событий в астроцитах, тогда как блокирование нейрональной активности уменьшало частоту кальциевых событий, но не влияло на их размеры и длительность. Амплитуда кальциевых событий не изменялась ни при изменении концентрации Ca2+ вне клетки, ни при блокировании нейрональной активности. II. Методы анализа и моделирование II.1 Оптимизация алгоритма подавления шума на основе оконного HOSVD-разложения с нелокальным группированием окон Проведен поиск в пространстве параметров, дающий оптимальные результаты для разных входных данных. Как правило, удается достичь такого же или лучшего уровня реконструкции сигнала, как при применении ранее разработанного метода, часто за счет более длительного времени расчета. Наборы параметров алгоритма NL-HOSVD, дающие минимальное значение среднеквадратичной ошибки реконструкции приведены в Таблице 1. В большинстве случаев наилучший результат давал вариант с минимальным числом временных компонент (time rank=5), но в случае данных с большим количеством небольших независимых источников сигнала (например, шаблон 7, оптимальный ранг был выше). Как правило, наилучшие результаты получались при умеренно высоком пороге отсекания коэффициентов структурного тензора (от 75 до 95%) и относительно коротких временных окнах, от 50 до 150 кадров. II.2 Тестирование алгоритмов tensor-SVD в контексте аппроксимации 3D и 4D данных и подавления шума Имплементирован и протестирован алгоритм тензорного SVD-разложения из (Kilmer PNAS 2021). Разработано несколько подходов к выделению порогового уровня коэффициентов разложения. В целом, метод позволяет добиться хорошего подавления шума и автоматически сглаживать входные данные, лучше, чем обычные основанные на SVD методы обрабатывает входные данные с пуассоновским шумом, но имеет тенденцию к формированию пространственных артефактов из-за того, что каждая плоскость в пространстве преобразования вдоль перпендикулярной оси аппроксимируется низкоранговой матрицей. В целом, дальнейшая оптимизация данного метода (выбор линейного преобразования, порога коэффициентов, рангов разложения) представляется перспективной. II.3. Адаптация разработанных ранее алгоритмов для работы с 4D изображениями Разработанные ранее алгоритмы адаптированы для работы с 4D изображениями в нескольких вариантах пользовательских сценариев. Необходимые изменения внесены в программный код разрабатываемых нами библиотек, используемых при анализе данных. II.4 Применение разрабатываемых методов анализа для обработки экспериментальных данных Впервые обнаружены кальциевые осцилляции в телах астроцитов in vivo на фоне формирования ответа на локомоцию животного. Количественно охарактеризована пространственная интеграция кальциевых ответов от периферии домена к соме. Количественно охарактеризована воспроизводимость пространственно-временных профилей кальциевого ответа астроцитов от одного эпизода движения к другому, как на уровне астроцитарного синцития, так и на уровне одиночных астроцитов. Подтверждено, что развитие кальциевого ответа астроцитах идет по сценарию разового быстрого появления надпороговых сегментов активности, которые, разрастаясь, захватывают все большую площадь и сливаются. Выявлено вторичное повышение спонтанной активности на фоне спада ответа на локомоцию. Это наблюдение воспроизводится в управляемых данными и механизменных моделях и требует дальнейшего исследования. II.5 Алгоритмы анализа морфологии сети митохондрий астроцитов Сформулированы и реализованы в виде программного кода подходы к стабилизации морфологических изображений митохондриальной сети астроцитов, анализа структуры с применением контраста Sato и анализа свойств скелета ярких тяжей, видимых в поле зрения. Покадровый анализ аппроксимированных первыми 50 главными компонентами данных демонстрирует тенденцию к повышению ширины филаментов и уменьшению длины скелета филаментов. Это может быть связано с изменением четкости изображения во время бега, если сдвиги кадра происходят быстрее, чем регистрируется каждый кадр (с учетом временного биннинга). На рис. 14 показан репрезентативный пример предлагаемого подхода к анализу изображений митохондриальной сети астроцитов. II.6 Управляемые данными модели Для большинства экспериментальных записей DMDс хорошо воспроизводит основные параметры кальциевого ответа на одиночные пробежки с плавным нарастанием скорости, включая распределение задержек и их пространственный профиль, характеристики средних значений ΔF/F, активной области, пики появления новых сегментов вначале ответа и сегментов в его конце. Установлено, что медианная задержка ответа уменьшается с ростом максимальной скорости и ускорения животного как в случае сетевой активности, так и на уровне одиночных астроцитов. Ответы DMD-моделей на парные эпизоды локомоции не воспроизводят периода рефрактерности и ослабления ответа на вторую пробежку. По-видимому, это связано с ограничениями линейных моделей, использующихся в методе DMD. Длительный эпизод локомоции и/или высокая скорость животного приводила к формированию вторичных и продолжающихся ответов (рис. 17). Это соотносится с экспериментальными наблюдениями (повышенная спонтанная активность после завершения ответа на локомоцию). II.7 Биофизическая 3D-модель кальциевой динамики в астроцитах, воспроизводящая ответ на локомоцию в контексте гипотезы об объемном выделении норадреналина Разработанная ранее модель кальциевой динамики в астроцитах доработана путем добавления дополнительного пути активации Gq-связанных рецепторов, связанного с выделением норадреналина (NA). Модель воспроизводит наличие задержки между началом высвобождения норадреналина и формированием глобального ответа, задержка и амплитуда ответа зависят от интенсивности выделения NA. Парные NA-стимулы выявили наличие рефрактерности в ответе на стимуляцию, что также согласуется с экспериментальными данными. Характерное время выхода из рефрактерности составляет около 1 мин. Конвертация модельных уровней концентрации кальция в сигнал флуоресценции позволила сравнить кальциевый ответ в модели с основными параметрами, рассчитываемыми для экспериментальных данных. Показано качественное соответствие как основных глобальных параметров кальциевого ответа, так и его пространственно-временные характеристики, включая пространственную интеграцию от периферии к соме. II.8 Описание морфологии астроцитов в виде направленного графа отростков Разработан и реализован алгоритм автоматической реконструкции структуры ветвления астроцита в виде направленного графа. Полученные графы могут использоваться для характеризации морфологии астроцитов и для модификации пространственных шаблонов для биофизических моделей кальциевой сигнализации. II.9 Влияние связности области тонких отростков на паттерны кальциевой динамики в моделях На биофизической модели исследовано влияние разобщенности и связности субдоменов пространственного домена астроцита на его кальциевую динамику. При низком уровне возбуждения увеличение разобщения приводит к понижению частоты спонтанно возникающих кальциевых волн, но при элиминации вокселей не на границе субдоменов, а в случайных местах области тонких отростков не оказывает такого эффекта, но видна тенденция к увеличению фоновой концентрации кальция в цитоплазме астроцита (рис. 20, верхняя группа панелей). При высоком уровне возбуждения случайная элиминация вокселей, принадлежащих области тонких отростков также приводит к повышению общего уровня цитоплазматического кальция. При этом частичное разобщение 0.05 < Pdel < 1.0 между субдоменами повышает вариабельность ответов и приводит к формированию неполных кальциевых волн, охватывающих только часть пространственного домена астроцита. При этом полное разобщение при Pdel = 1.0, наоборот, характеризуется стереотипными ответами. По-видимому, это связано с конкуренцией отдельных субдоменов за инициацию глобальной кальциевой волны, и полное разобщение позволяет отдельно взятому субдомену оказаться лидером инициации кальциевых волн. Примечательно, что рандомизированная элиминация аналогичного количества пикселей сохраняет вариабельность паттернов кальциевой активности при Pdel > 0. Требуется дальнейшее исследование наблюдаемых результатов III. Мониторинг степени оксигенации крови в сосудах и редокс-состояния ЭТЦ митохондрий астроцитов и нейронов Мы показали, что КР-спектры, зарегистрированные от идентифицированных астроцитов и нейронов соматосенсорной коры мышей in vivo имеют сходную структуру, демонстрируя выраженные пики с положениями 750, 1126 и 1585 см-1, связанные с колебаниями атомов в молекулах гемов восстановленных цитохромов В и С-типов в ЭТЦ митохондрий, а также пики с положениями 1003 и 1660 см-1, связанные с колебаниями Phe-радикала и пептидных связей в белках, соответственно, а также пик с положением 1440 см-1, связанный с колебаниями -СН2- и С-С связей в липидах (Рис.21Г). При этом известно, что пик с положением 750 см-1 в большей степени зависит от восстановленного цитохрома С, а пик с положением 1126 см-1 — от восстановленных цитохромов В-типа. Экспрессия флуоресцентных белков GFP и NirFP в астроцитах и нейронах, соответственно, позволяет визуализировать и идентифицировать астроциты и нейроны и при этом флуоресценция указанных белков не мешает регистрировать КР-спектры клеток мозга. КР-спектры, зарегистрированные от кровеносных сосудов коры мозга мышей, представляют собой сочетание пиков, положения максимумов которых зависит от наличия/отсутствия кислорода, связанного на гемоглобине (Рис.21Д,Е). Учитывая эту особенность спектров КР крови, а также то, что при длине волны возбуждения 532 нм КР-сигнал дГб более интенсивен, чем у оГб (коэффициент 1.44 — рассчитан при сопоставлении интенсивностей спектров КР чистого оГб и чистого дГб), то по соотношению, рассчитываемому, как sO2=1.44×I1585/(I1547+1.44×I1585), определяли локальную оксигенацию крови (относительное содержание оГб по отношению к общему количеству Гб). III.1. Неоднородность редокс-состояния ЭТЦ митохондрий тел астроцитов и их отростков на поверхности кровеносных сосудов in vivo Мы получили КР-карты участков соматосенсорной коры мозга мышей в состоянии покоя, локомоции (бега) по беговой дорожке и отдыха. Предварительно по флуоресценции GFP определяли места локализации астроцитов непосредственно около сосуда. Мы показали, что при беге: (1) происходит увеличение степени оксигенированности крови в сосудах коры мозга с увеличением диаметра сосудов, (2) относительное содержание восстановленных цитохромов С и В-типов при беге увеличивается неоднородно по астроциту, есть области с большей степенью заполненности ЭТЦ электронами (Рис.22, участки ткани около сосуда с “желтым цветом”) и области с меньшим содержанием электронов в ЭТЦ (Рис.22, участки ткани около сосуда с “зеленым цветом”). В состояниях покоя и отдыха после бега выраженной неоднородности астроцитов по редокс-состоянию цитохромов ЭТЦ не наблюдается. Можно предположить, что такая неоднородность связана с функционально разным ответом митохондрий астроцитов на нагрузку и с особенностями расположения в концевой ножке астроцитах в области сосуда митохондрий с различной морфологией и/или разным содержанием комплексов ЭТЦ. На следующем этапе проекта это предположение будет проверено в экспериментах по визуализации распределения митохондрий в отростках астроцитов с анализом морфологии митохондрий астроцитов in vivo у бодрствующих мышей в различных функциональных состояниях. Для дополнительного исследования возможной неоднородности астроцитов по редокс-состоянию митохондрий были получены КР-карты астроцитов и нейронов в различных участках коры в фиксированных срезах мозга (Рис. 23А). полученные КР-карты астроцитов были разбиты на участки тела астроцита и концевые ножки, прилегающие к кровеносному сосуду. Спектры КР астроцитов и нейронов в фиксированных срезах коры имеют структуру, сходную со структурой спектров, регистрируемых от астроцитов и нейронов in vivo (Рис.23Б и В) с выраженными пиками от холестерина, фосфатидилхолина и восстановленного цитохрома С. Мы получили, что в условиях отсутствия функциональной нагрузки концевые ножки и тела астроцитов не отличаются по редокс-состоянию цитохромов и белок-липидному составу (Рис.23.Г-Ж). При этом астроциты обладают повышенным относительным содержанием восстановленного цитохрома С по сравнению с нейронами, а также более высоким относительным (Рис. 23.З-Л) содержанием фосфатидилхолина и холестерина. Обнаруженные отличия астроцитов и нейронов могут объясняться разным устройством их ЭТЦ (отдельно расположенными комплексами в ЭТЦ астроцитов и респирасомами - суперкомплексами ЭТЦ в нейронах), а также накоплением в астроцитах липидных капель и синтезом холестерина. III.2. Редокс-состояние митохондрий астроцитов и нейронов изменяется разнонаправленно при физиологической нагрузке in vivo при увеличении оксигенации крови в артериолах и венулах Установлено, что КР-спектры астроцитов и нейронов изменяются при совершении мышами беговых движений по беговой дорожке (Рис. 24). Впервые в условиях in vivo с пространственным разрешением менее 1 мкм мы показали, что и венулы, и артериолы отвечают сходным образом на локомоцию - локальным и обратимым увеличением степени оксигенации крови, что связано с общим системным эффектом бега (Рис.24.Г-Ж), но при этом редокс-состояние митохондрий в астроцита и нейронах изменяется при беге разнонаправленно. Так, в митохондриях астроцитов при локомоции мышей увеличивается относительное содержание восстановленных цитохромов, что свидетельствует о заполнении ЭТЦ электронами (Рис. 24В), а в митохондриях нейронов, напротив, при локомоции в митохондриях снижается относительное содержание восстановленных цитохромов, что говорит об ускорении переноса электронов в ЭТЦ (Рис. 24В). Мы полагаем, что такое отличие ответов митохондрий астроцитов и нейронов связано с различной структурой их ЭТЦ, а также различиями в метаболизме. Так, в нейронах именно митохондрии являются основным источником АТФ, в то время, как в астроцитах АТФ синтезируется в результате гликолиза и окислительного фосфорилирования. III.3. Изучение изменения конформации гема цитохрома С в изолированных митохондриях при изменении скорости переноса электрона в дыхательной цепи. С использованием серебряных плазмонных наноструктур мы получили спектры ГКР от окисленного цитохрома С в митохондриях и показали, что при действии блокаторов комплекса III — миксотиазола и антимицина — уменьшается вероятность плоской конформации гема цитохрома С (Рис.25), что будет приводить к снижению способности цитохрома С принимать электрон от своего редокс-партнера. Можно предположить, что такое изменение конформации гема цитохрома С может носить адаптивный характер для снижения вероятности окисления кардиолипина внутренней мембраны митохондрий под действием окисленного цитохрома С при ингибировании комплекса III. Исходя из полученных результатов можно предположить, что in vivo замедление или ингибирование работы комплекса III будет приводить к таким же эффектам, препятствуя цитохром С-зависимому окислению митохондриальных мембран.
3 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Интеллектуальные методы обработки и анализа данных флуоресцентного имиджинга кальциевой активности в астроцитах и мультиспектральных исследований нервной ткани
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".