ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Соответственно, целью настоящего проекта является исследование ряда новых клеточных белков – партнеров интегразы ВИЧ-1 и валидация их комплексов с интегразой в качестве потенциальных мишеней для новых антиретровирусных препаратов.
Accordingly, the aim of this project is to study a number of new cellular partners of HIV-1 integrase and validate their complexes with integrase as potential targets for new antiretroviral drugs.
1. В результате реализации проекта будут идентифицированы новые клеточные белки, взаимодействующие с интегразой ВИЧ-1. 2. Среди всех идентифицированных партнеров интегразы будут определены те, взаимодействие которых с интегразой действительно важно для репликации ВИЧ-1, и определены стадии(стадия) репликативного цикла, на которые они влияют. 3. Будет исследовано взаимодействие интегразы и ряда ее мутантов с рекомбинантными белками-партнерами и установлены сайты связывания этих белков в структуре интегразы. 4. С использованием псевдовирусов, содержащий в гене интегразы мутации, приводящие к нарушению ее связывания с тем или иным белком-партнером, будет установлено, насколько взаимодействие интегразы и исследуемого белка важно для репликации вируса.
При выполнении проекта РНФ № 17-04-01178 нами установлено, что клеточный гетеродимерный белок Ku принимает участие в процессе репарации повреждений в геномной ДНК, возникающих в результате интеграции в нее кДНК вирусного генома, причем для успешной репарации необходимо взаимодействие интегразы ВИЧ-1 и субъединицы Ku70. В результате проделанной работы мы смогли показать, что комплекс интегразы и Ku70 может рассматриваться как новая мишень для ингибиторов репликации ВИЧ-1.
Основным результатом проекта будет идентификация новых клеточных белков, взаимодействие которых с интегразой ВИЧ-1 важно для успешной репликации вируса. Соответственно, комплексы этих белков и интегразы можно будет рассматривать в качестве новой терапевтической мишени для разработки анти-ВИЧ-препаратов, обеспечивающих высокий генетический барьер для развития лекарственно устойчивых штаммов вируса.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 16 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Поиск новых клеточных партнеров интегразы ВИЧ-1 |
Результаты этапа: 1. Идентификация клеточных белков - потенциальных партнеров интегразы, найденных при двух вариантах кросс-линкинга с последующей иммунопреципитацией комплексов на смоле с иммобилизированными анти-НА антителами и LС-MS анализом. Анализ белков, связавшихся ковалентно с интегразой ВИЧ-1 под действием формальдегида, позволил нам идентифицировать белки LEDGF/p75, PARP1, Cofilin-1 (CFL1), DNAJA1, DNAJA2, Hsp60 (HSPD1), UBR5, RBBP7, AHCY, IPO5, CACYBP, WDR82, SDF2L1 и 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ). В результате анализа образцов белков, сшитых с интегразой под действием DSSO, были также идентифицированы известные партнеры интегразы LEDGF/p75 и Ku70, что подтверждает корректность проведенного эксперимента. Помимо этого, были идентифицированы белки PARP1, AHCY и 14-3-3 zeta/delta, ранее обнаруженные нами по результатам кросс-линкинга формальдегидом, а также SFPQ. Для белков PARP1, Cofilin-1, DNAJA2, WDR82, DNAJA1, Hsp60 и SFPQ уже было показано их участие в репликации ВИЧ-1, однако ни для одного из них, кроме SFPQ, не было экспериментально обнаружено связывания с интегразой. Для найденных нами белков UBR5, RBBP7, AHCY, IPO5, CACYBP, SDF2L1 и 14-3-3 zeta/delta данных об их участии в репликации ВИЧ-1 нет. 2. Получение эукариотических экспрессионных векторов, кодирующих выявленные партнеры интегразы ВИЧ-1 с 3xFlag-довеском на C-конце. Эукариотические экспрессионные вектора с 3xFlag-довеском на C-конце были получены на базе имеющегося в лаборатории вектора pcDNA3.1-Ku70_3xFlag путем замены гена Ku70 последовательностью гена исследуемого белка. Наработка целевых генов была осуществлена с использованием ПЦР с праймерами к 5’- и 3’-концевым областям белок кодирующей последовательности каждого целевого гена с использованием кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции, в качестве матрицы. Удалось получить гены всех белков, кроме PARP1. Соответственно, были получены экспрессионные вектора, содержащие гены CFL1, DNAJA1, DNAJA2, HSPD1, UBR5, RBBP7, AHCY (две изоформы), IPO5, CACYBP (две изоформы), WDR82, SDF2L1, SFPQ и YWHAZ. 3. Дополнительный отбор белков-партнеров интегразы по результатам анализа взаимодействия эктопически экспрессированных НА-тагированной интегразой ВИЧ-1 и 3xFlag-тагированных исследуемых белков методом ко-иммунопреципитации c использованием анти-НА антител. С помощью ко-иммунопреципитации эктопически экспрессированных НА-тагированной интегразой ВИЧ-1 и 3xFlag-тагированных исследуемых белков нам удалось подтвердить взаимодействие между интегразой ВИЧ-1 и клеточными белками: DNAJA1, AHCY1, AHCY2, Hsp60 (HSPD1), 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ), CACYBP1. Для белков RBBP7, CACYBP2, DNAJA2, WDR28 и Cofilin-1 (CFL1) нам не удалось показать образования комплекса с интегразой ВИЧ-1 данным методом. Учитывая, что нам не удалось получить экспрессионный вектор для белка PARP1, для анализа его связывания с интегразой ВИЧ-1 был использован рекомбинантный белок PARP1, любезно предоставленный нам академиком Лаврик О.И. В результате было установлено, что рекомбинантная интеграза ВИЧ-1 способна эффективно связываться с белком PARP1. 4. Идентификация партнеров интегразы ВИЧ-1, влияющих на репликацию ВИЧ-1, по результатам анализа эффективности трансдукции клеток лентивирусным вектором в условиях измененной внутриклеточной конценрации целевых белков. С использованием VSV-G-псевдотипированного репликативно-некомпетентного вектора на основе генома ВИЧ-1, в геноме которого закодирована люцифераза светлячка, было показано, что суперэкспрессия только двух белков из всего исследуемого набора статистически значимо влияет на эффективность трансдукции лентивирусным вектором. Один из таких белков 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ) негативно влиял на репликацию ВИЧ-1, второй белок – Hsp60 (HSPD1), наоборот, активировал репликацию. В дальнейшем мы планируем проверить полученные результаты, повторив эти эксперименты и в условиях суперэкспрессии 3xFlag-тагированных целевых белков и при понижении их внутриклеточного уровня с помощью миРНК. На основе проведенных экспериментов по связыванию интегразы ВИЧ-1 с исследуемыми белками и их влияния на трансдукцию клеток линии HEK293T VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе генома ВИЧ-1 мы планируем в дальнейшем продолжить работу с белками PARP1, DNAJA1, Hsp60 (HSPD1), AHCY (двумя изоформами AHCY1 и AHCY2), CACYBP (изоформа CACYBP1) и 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ), а также SFPQ, который был идентифицирован нами по результатам кросс-линкинга реагентом DSSO. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Идентификация новых клеточных партнеров интегразы ВИЧ-1 |
Результаты этапа: 1. В результате проведения экспериментов по определению эффективности трансдукции клеток линии HEK293T VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе генома ВИЧ-1 в условиях измененной внутриклеточной концентрации исследуемых белков отобраны белки, SFPQ, VBP1, DNAJA1 и CACYBP1, обеспечивающие наибольшее влияние на эффективность трансдукции клеток линии HEK293T этим вектором. 2. Установлено, что изменение уровня белка PARP1 не оказывает влияния на уровень экспрессии люциферазы, который коррелирует с эффективностью трансдукции, однако экспрессия люциферазы увеличивается при снижении уровня белка PARP2 в клетках. Установлено, что каталитическая активность белка PARP2 важна для эффективной репликации используемого нами VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе генома ВИЧ-1. 3. Установлено, что белки DNAJA1 и CACYBP1 влияют не на ранние стадии репликации ВИЧ-1, а на транскрипцию с CMV-промотора. 4. Установлено, что белок SFPQ влияет на стадию интеграции. 5. Методом соосаждения белков установлено, что рекомбинантные белки SFPQ, VBP1 и PARP2 взаимодействуют с рекомбинантной интегразой ВИЧ-1. Этот результат подтверждает, что идентифицированные нами белки, влияющие на репликацию ВИЧ-1, действительно являются партнерами интегразы ВИЧ-1. 6. С использованием делеционных мутантов интегразы ВИЧ-1 проведены эксперименты по установлению участков интегразы, ответственных за связывание с исследуемыми белками-партнерами. Достоверно установлено, что для взаимодействия с PARP1 достаточно региона 51-190 а.к., который находится в каталитическом домене, а сайт связывания SFPQ находится в регионе 160-190 а.к. Методом пептидного «фишинга» показано, что с SFPQ специфично связывается пептид 171-202 а.к., который как раз находится в определенном нами участке связывания. Методом сайт-направленного мутагенеза показано, что только замена остатка R187 нарушает связывание между интегразой и SFPQ. 7. Охарактеризованы точечные мутанты интегразы с заменами I182A, R187А и K188A. Установлено, что аминокислота R187 важна для репликации вируса как на стадии обратной транскрипции. Аминокислота K188 оказалась важна для успешного протекания обратной транскрипции и не влияла на интеграцию. Аминокислотная замена I182А, наоборот, снижала эффективность интеграции. 8. Осуществлен анализ способности ряда низкомолекулярных соединений блокировать взаимодействие интегразы с ДНК-связывающей субъединицей ДНК-зависимой протеин-киназы (ДНК-ПК) – белком Ku. Впервые установлено, что ингибитор связывания интегразы с Ku способен подавлять репликацию псевдовируса в клетках на уровне пост-интеграционной репарации. Крайне важно при этом, что этот ингибитор никак не влияет на репарацию двуцепочечных разрывов в ДНК по механизму негомологичного соединения концов, основным участником которой является ДНК-ПК. | ||
3 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Характеристика новых клеточных партнеров интегразы ВИЧ-1 |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".