ИСТИНА

Идеей проекта является разработка ферментного комплекса на основе пищеварительных пептидаз насекомых семейства Tenebrionidae с перспективой создания препарата для энзимотерапии целиакии. Целиакия – это хроническое наследственное аутоиммунное заболевание, характеризующееся стойкой непереносимостью глютена с развитием атрофии слизистой оболочки тонкой кишки, связанного с ней синдрома мальабсорбции и развитием различных дефицитных состояний (Farrell and Kelly, 2002. Methods Enzymol. 25, 464-468; Cappello et al., 2016. Clin. Med. Insights Gastroenterol. 9, 41-49). У предрасположенных людей аутоиммунная реакция возникает на длинные, не гидролизуемые токсические пептиды глиадинов (основного компонента глютена). Глиадины являются главными запасными белками семян пшеницы и содержат в своем составе последовательности, отличающиеся высоким содержанием глутамина (30-50%) и пролина (10-30%) (Shewry and Tatham, 1990. Biochem. J. 267, 1-12; Shewry and Halford, 2002. J. Exp. Bot. 53(370), 947-958), что обеспечивает их высокую устойчивость и стабильность к действию протеолитических ферментов широкого спектра действия. В природе гидролиз таких белков проходит эффективно только под действием пептидаз, специфично расщепляющих пептидные связи, образованные остатками глутамина (post-glutamine cleaving peptidases (PGP)), и пролина (proline-specific peptidases (PSP)). Комплекс пищеварительных пептидаз человека не содержит в своем составе специализированных PGP и PSP. На наш взгляд, наиболее перспективен в этом отношении природный комплекс пищеварительных пептидаз насекомых Tenebrionidae, основными пищевыми белками которых являются глиадины и другие проламины семян злаковых. Это обусловливает наличие у этих организмов высокоактивных пептидаз, специфичных в отношении гидролиза указанных белков и их пептидных фрагментов - PGP и PSP.

The idea of ​​the project is the development of an enzyme complex based on digestive peptidases of Tenebrionidae insects with the prospect of creating a drug for treatment of Celiac disease. Celiac disease is a chronic hereditary autoimmune disease characterized by persistent intolerance to gluten with the development of atrophy of the small intestinal mucosa, associated malabsorption syndrome and the development of various deficient states (Farrell and Kelly, 2002. Methods Enzymol., 25, 464-468; Cappello et al. , 2016. Clinical Med. Insights Gastroenterol. 9, 41-49). In genetically predisposed people, the autoimmune reaction occurs on long, non-hydrolysable toxic peptides of gliadins (the main component of gluten). Gliadins are the main storage proteins of wheat seeds and contain sequences rich with glutamine (30-50%) and proline (10-30%) residues (Shewry and Tatham, 1990. Biochem, J. 267, 1-12; Shewry and Halford, 2002. J. Exp., Bot. 53 (370), 947-958), which ensures their high stability to the action of broad-spectrum proteolytic enzymes. In nature, the hydrolysis of such proteins is effective only under the action of peptidases specifically cleaving the peptide bonds formed by glutamine residues (postglutamine cleavage peptidases (PGP)) and proline (proline-specific peptidases (PSP)). The complex of human digestive peptidases does not contain specialized PGP and PSP. The most promising in this respect is the natural complex of digestive peptidases of insects Tenebrionidae, the main food proteins of which are gliadins and other prolamins of cereal seeds. This determines the presence in these organisms of highly active peptidases, specific for the hydrolysis of these proteins and their peptide fragments - PGP and PSP.

1. Будут оптимизированы условия получения и очистки PGP - рекомбинантного катепсина L T. castaneum, выбраны оптимальные условия процессинга, проведена характеристика его субстратной и ингибиторной специфичности. 2. Будет получен рекомбинантный препарат PSP - DPP 4 T. molitor. 3. Будет исследован гидролиз главных запасных белков семян пшеницы - глиадинов, полученными рекомбинантными ферментами. 4. Будет изучена специфичность гидролиза токсических пептидов глиадинов рекомбинантными катепсином L и DPP 4. 5. Будет изучен совместный и последовательный гидролиз глиадинов пищеварительными пептидазами тенебрионид. 6. Будет изучена стабильность полученного ферментного комплекса при хранении.

Нами уже получен препарат рекомбинантного катепсина L T. castaneum в системе клеток дрожжей P. pastoris. Показана способность данного фермента гидролизовать пептидные субстраты, представляющие собой фрагменты токсических пептидов глиадинов, что делает его перспективным для разработки ферментного комплекса, заявленного в данном проекте (Воротникова и др. 2015. Сборник тезисов "VII Российский симпозиум "Белки и пептиды" Новосибирск, 12-17 июля 2015", с. 350). Среди PSP T. molitor наиболее высокоэкспрессируемой является секретируемая пищеварительная сериновая дипептидилпептидаза 4 (DPP 4). Нативный фермент был выделен из кишечника личинок T. molitor, идентифицирован с использованием масс-спектрометрических подходов. Для фермента показана способность гидролизовать глиадины, что является перспективным для создания ферментного препарата (Tereshchenkova et al., 2016. Insect. Biochem. Mol. Biol. 76, 38-48). В ходе данного проекта планируется получение рекомбинантного препарата наиболее высокоэкспрессируемой пищеварительной PSP T. molitor - DPP 4. Специфичность обоих ферментов отвечает составу глиадинов: катепсин L способен эффективно гидролизовать связи, образованные остатками глутамина, а DPP 4 - пролина, что делает возможным реализацию предложенной идеи и создание ферментного комплекса с перспективой разработки препарата для энзимотерапии целиакии.

1. Оптимизированы условия получения и очистки PGP - рекомбинантного катепсина L T. castaneum, выбраны оптимальные условия процессинга (инкубирование при рН 3,0-4,0 90 минут при 37 градусах по Цельсию), проведена характеристика его субстратной и ингибиторной специфичности. Показано, что наиболее эффективно полученный фермент гидролизует субстрат, содержащий остаток глутамина в положении P1. 2. Получен рекомбинантный препарат PSP - DPP 4 T. molitor. Проведено изучение влияния рН на активность и стабильность. Оптимум работы выявлен при рН 8,0. 3. Исследован гидролиз главных запасных белков семян пшеницы - глиадинов, полученными рекомбинантными ферментами. Показано, что катепсин L, являясь эндопептдазой, осуществляет этот гидролиз эффективнее. 4. Исследована специфичность гидролиза фрагментов токсических пептидов глиадинов полученными ферментами. Показано, что катепсин L гидролизует пептиды после остатка глутамина внутри цепи, а DPP4 отщепляет дипептиды с N-конца. 5. Изучен совместный гидролиз глиадинов пищеварительными пептидазами насекомых тенебрионид. Показано, что среди отдельных ферментов наибольшей эффективностью обладают цистеиновые эндопептидазы, а каждая из найденных PSP вносит значительный вклад в гидролиз изучаемых пищевых белков. При совместном действии ферментов наблюдается синергетический эффект. 6. Изучена стабильность полученного ферментного комплекса при хранении. Показано, что и рекомбинантный катепсин L и DPP4 сохраняют порядка 90% исходной активности при хранении при низких температурах.