ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Шаперонины – класс молекулярных шаперонов, которые помогают правильно сворачиваться как новосинтезированным полипептидным цепям, так и денатурированным под воздействием стресса белкам. Шаперонины, найденные в прокариотах (группа I) и эукариотах и архебактериях (группа II), интенсивно изучаются на протяжении нескольких десятилетий. Цель настоящего проекта – изучение вирусных шаперонинов, которые обнаружены нами сравнительно недавно, и, скорее всего, являются новой группой шаперонинов. Объектами исследования являются шаперонины, идентифицированные в геноме родственных бактериофагов EL и RU Pseudomonas aeruginosa. Они синтезируются in vivo при размножении фагов в бактериальных клетках. Нами разработаны система экспрессии генов, кодирующих фаговые шаперонины, в клетках E. coli, а также метод очистки рекомбинантных белков. Фаговые шаперонины подобно GroEL являются гомоолигомерными комплексами и состоят из 14 субъединиц, которые формируют два стопкой уложенных гептамерных кольца и имеют внутренний канал. Основными задачами нашего исследования являются: выяснение роли шаперонинов в процессе морфогенеза фаговых частиц; характеристика рекомбинантных белков и их комплексов с низкомолекулярными лигандами и белками-субстратами различными физико-химическими методами (равновесное ультрацентрифугирование, изотермическое калориметрическое титрование, калориметрия); изучение структуры шаперонинов в различных конформационных состояниях в растворе методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Полученные данные позволят охарактеризовать вирусные шаперонины, изучить свойства и структуру комплексов, а также понять механизм их функционирования.
Основные задачи нашего исследования: 1. Выяснить роль вирусного шаперонина в процессе морфогенеза фаговой частицы. Для этого мы планируем идентифицировать и изучить белки-субстраты, фолдинг которых протекает при участии шаперонина. Получить рекомбинантные белки-субстраты и провести опыты in vitro по рефолдингу их денатурированных форм в присутствии рекомбинантного шаперонина. 2. Охарактеризовать рекомбинантный шаперонин и изучить его свойства различными физико-химическими методами. Найти условия получения шаперонина в различных конформационных состояниях. 3. Для понимания механизма функционирования вирусного шаперонина исследовать структуру рекомбинантного белка и его комплексов в различных конформационных состояниях в растворе методом малоуглового рентгеновского рассеяния.
Шаперонины прокариот, эукариот и архебактерий интенсивно изучаются на протяжении нескольких десятилетий. Мы впервые получили экспериментальные доказательства того, что и вирусы могут кодировать собственные шаперонины на примере ранее обнаруженного нами ортолога GroEL в бактериофаге EL P. aeruginosa. Очищенный препарат рекомбинантного вирусного шаперонина – продукта гена (пг) 146 фага EL, продуцированный клетками E. coli, был охарактеризован различными физико-химическими методами: аналитическое ультрацентрифугирование, динамическое светорассеяние, электронная микроскопия, дифференциальная сканирующая калориметрия, изотермическая титрационная калориметрия, спектроскопия кругового дихроизма, флуоресцентная спектроскопия, малоугловое рассеяние рентгеновских лучей. Установлено, что вирусный шаперонин является тетрадекамером: он состоит из двух стопкой уложенных колец, содержащих по 7 субъединиц, – и имеет внутренний канал. Показано, что пг146 денатурирует кооперативно и необратимо, процесс денатурации не зависит от концентрации белка. Шаперонин связывает как АТФ, так и АДФ, причем, только одно кольцо в рекомбинантном пг146 может связывать нуклеотид. Установлено, что шаперонин обладает АТФазной активностью. На основе антител против рекомбинантного пг146 с помощью иммунопреципитации были выделены комплексы шаперонина с белками-субстратами из лизата бактериальных клеток, инфицированных фагом EL. Методом масс-спектрометрии идентифицирован один из белков-субстратов – пг188 (эндолизин). Наряду с рекомбинантным пг188 получен в растворимой форме фрагмент другого белка фага EL, обладающего литической активностью (пг183). Используя полученные белки в качестве субстратов, в опытах in vitro показано, что подобно бактериальному шаперонину GroEL пг146 способен подавлять агрегацию развернутых при нагревании молекул субстратов как в присутствии АТР, так и без него. В первом случае шаперонин функционирует по АТРазному циклу, приводя к образованию правильно собранных и ферментативно активных субстратов. Во втором – пг146 образует стабильный бинарный комплекс с развернутыми молекулами субстратов, лишь пассивно защищая их от агрегации, ренатурации субстратов при этом не происходит. Полученные результаты являются доказательством того, что пг146 выполняет функцию шаперонина. В отличие от GroEL, вирусный шаперонин функционирует без кошаперонина. На основе кривых малоуглового рассеяния с помощью компьютерного моделирования восстановлена форма вирусного шаперонина в комлексах с АТФ и АДФ, уточнены размеры частиц. На основе фторидов бериллия и алюминия получены комплексы апо-формы вирусного шаперонина с негидролизуемыми аналогами АТФ, различающиеся по конформации. Получен и охарактеризован комплекс вирусного шаперонина с субстратом – фрагментом пг183 (стехиометрия связывания ~ 1:1).
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2011 г.-31 декабря 2013 г. | Вирусные шаперонины: структура, свойства и механизм функционирования |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".