ИСТИНА

Задачей проекта является рассмотрение и оценка максимального числа факторов, обеспечивающих нормальное функционирование митохондрий, которое определяет сохранение функционирования клетки в нормальном режиме. Мы базируемся на доказательствах, что изменения в структуре и функциях митохондрий может приводить к возникновению патологического фенотипа клетки, причем основным индикатором изменения функциональности митохондрий являются изменения трансмембранного потенциала (ТМП) на внутренней митохондриальной мембране. Учитывая исключительную важность ТМП для статуса клетки-хозяина, мы постулируем наличие гомеостаза ТМП, позволяющего изменения ТМП в небольших пределах без особых последствий для клетки. Это накладывает требования для экспериментатора адекватно и однозначно оценивать значения ТМП в клетке, никаким образом не допуская выход из допустимого «окна», и такой теоретический и экспериментальный анализ был проведен нами в 2021 году. По нашим представлениям гиперполяризация митохондрий приведет к опасной гиперпродукции активных форм кислорода (АФК), а сильная деполяризация запустит деградационные процессы, заканчивающиеся гибелью клетки. В пределах допустимых значений ТМП напрямую регулирует производство митохондриями АФК, причем эта зависимость нелинейная, но основой является то, что с повышением ТМП происходит экспоненциальное увеличение синтеза АФК. Таким образом ТМП в пределах допустимого «окна» является тем положительным фактором, который регулирует уровень АФК, играющих важную сигнальную роль, задаваемую физиологическим статусом клетки. Клетка обладает способностью самостоятельно регулировать значения ТМП в зависимости от физиологической нагрузки, однако внешние и внутренние факторы приводят к избыточной генерации АФК, которая обычно сопровождает такие патологии как ишемия, возникающая при инфарктах различных органов. В этих случаях необходимо постороннее вмешательство в функционирование митохондрий и клетки, и на практике, одним из возможных путей регуляции ТМП является использование т.н. «мягких» разобщителей окислительного фосфорилирования. Надо отметить, что механизм разобщения до сих пор вызывает споры, но начинает превалировать точка зрения, что разобщение опосредуется белками – резидентами внутренней мембраны. Мы ставим задачу найти мишень для мягких разобщителей. Эта задача будет реализована через специфическое мечение флуоресцентными производными митохондриально-направленных веществ, не содержащих антиоксидантной группы, и на разных моделях доказавших способность обеспечивать перенос протона через внутреннюю митохондриальную мембрану. Мы предполагаем, что такой мишенью является компонент АТР синтазого комплекса, и разобщение вызывается прохождением протона через канал Fo АТР синтазы. Мы получили предварительные данные, указывающие на реальность такого допущения. Это позволит представить фармакологическую мишень воздействия с целью обеспечить регуляцию значений ТМП с для недопущения или распространения патологических процессов. Кроме этого, основываясь на на ранее доказанном нами факте, что ионы калия как и протоны могут транспортироваться через Fo сопряженно с синтезом АТР, в рамках перечисления всех возможных функций ТМП, мы оценим участие его в регуляции транспорта ионов калия в митохондриях. Таким образом мы не только представим новый тип биоэнергетики, но и опишем механизм его работы. Одновременно мы разовьем и протестируем гипотезу, что сопряженная с окислением функциональная деятельность митохондрий, ассоциируемая с генерацией в матриксе большого объемы воды, может обеспечить векторное перемещение митохондрий в клетке за счет регулируемой и направленной генерации реактивной силы. В рамках наших представлений о гетерогенности популяции биологических систем, включая митохондрии, мы оценим гетерогенность внутриклеточной популяции митохондрий на основании приписываемым им значениям ТМП и разберем ряд примеров, включая сравнение разного типа клеток, и, прежде всего, стволовых и дифференцированных клеток, используя трансгенных животных, у которых стволовые клетки легко детектируются за счет экспрессии в них зеленого флуоресцентного белка. Применив оригинальную методику, мы сумеем оценить структуру и ультраструктуру митохондрий отдельно выбранной клетки и припишем изменения структуры к функциональным особенностям каждой клетки.

The objectives of the project are to consider and evaluate the maximum number of factors that provide the normal functioning of mitochondria, which determines the preservation of the functioning of the cell in normal mode. We base our research on the evidence that changes in the structure and functions of mitochondria can lead to the appearance of a pathological cell phenotype, and the main indicator of changes in the functionality of mitochondria are changes in the transmembrane potential (TMP) on the inner mitochondrial membrane. Taking into account the exceptional importance of TMP for the status of the host cell, we postulate the presence of TMP homeostasis, which allows changes in TMP within small limits without any special consequences for the cell. This imposes requirements for the experimenter to adequately and unambiguously assess the values of TMP in the cell and in no way allow an exit from the permissible "window", and such a theoretical and experimental analysis was carried out by us in 2021. According to our ideas, hyperpolarization of mitochondria will lead to dangerous hyperproduction of reactive oxygen species (ROS), and strong depolarization will trigger degradation processes ending in cell death. Within acceptable values, the TMP directly regulates the production of ROS by mitochondria, and the dependence is nonlinear, but the basis is that with an increase in TMP, an exponential increase in ROS synthesis occurs. Thus, TMP within the permissible "window" is the positive factor that regulates the level of ROS, which play an important signaling role set by the physiological status of the cell. The cell has the ability to independently regulate the levels of TMP depending on the physiological load, however, external and internal factors can lead to excessive generation of ROS, which usually accompanies pathologies such as ischemia, which occurs during infarctions of various organs. In these cases, external interference in the functioning of mitochondria and cells is necessary, and in practice, one of the possible ways to regulate TMP is the use of so-called "mild" uncouplers of oxidative phosphorylation. It should be noted that the mechanism of uncoupling is still controversial, but the point of view that uncoupling is mediated by resident proteins of the inner membrane is beginning to prevail. Our current goal is to find a target for mild uncouplers. This task will be realized through specific labeling with fluorescent derivatives of mitochondria-targeted substances that do not contain an antioxidative group, and on different models that have proven the ability to provide proton transfer through the inner mitochondrial membrane. We hypothesized that such a target is a component of the ATP synthase complex and the uncoupling is caused by the transport of a proton through the Fo channel of the ATP synthase. We have received preliminary data indicating the reality of such an assumption. This will make it possible to present a pharmacological target of exposure in order to ensure the regulation of the values of TMP in order to prevent or stop the spread of the pathological process. In addition, as part of the presenting of all possible functions of TMP, we will evaluate its participation in the regulation of potassium ion transport in mitochondria, having previously proved that potassium ions, like protons, can be transported through Fo coupled with the synthesis of ATP. Thus, we will not only present a new type of bioenergetics but also describe the mechanism of its operation. On the other hand, we will develop and test the hypothesis that the functional activity of mitochondria associated with oxidation, accompanied with the generation of large volumes of water in the matrix, can enable the vector movement of mitochondria in the cell due to the regulated and directed generation of reactive force. Within the framework of our ideas about the heterogeneity of the population of biological systems, including mitochondria, we will evaluate the heterogeneity of the intracellular population of mitochondria based on the values of TMP attributed to them and analyze a number of examples, including a comparison of different types of cells and, above all, stem and differentiated cells, using transgenic animals in which stem cells are easily detected due to the expression of green fluorescent protein in them. Applying the original technique, we will be able to evaluate the structure and ultrastructure of the mitochondria of a selected single cell and attribute the changes in structure to the functional features of each cell.

Оставаясь в общем контексте главенства ТМП в функционировании митохондрий и клеток, мы будем дополнять эту концепцию данными, прежде всего касающимися регуляции ТМП и его участии в других клеточных функциях. Новыми, пока не слишком развитыми сторонами исследования будут взаимоотношения структуры и функций митохондрий разного типа клеток. Мы отталкиваемся от идеи, что не только клетки, но и митохондрии надо рассматривать крайне индивидуально как отдельных членов популяции в клетке, причем очевидна не только специализация клеток, но и специализация отдельных митохондрий в этих разных по функциям клетках. При этом митохондрии быстро делящихся клеток по структуре и функциям будут отличаться от таковых у относительно покоящихся клеток, и начавшаяся в первой части проекта характеристика стволовых и дифференцированных клеток получит логическое продолжение по приписанию уже подтвержденной разницы в чувствительности митохондрий этих клеток к окислительному стрессу к структурным характеристикам, сделанным как на уровне обычного микроскопического, так и электронномикроскопического анализа. Мы предполагаем для такой работы использовать уникальную технику, которой сегодня не владеет никто в мире, но которая была уже использована на практике в коллективе, задействованном в проекте, в 80-х годах прошлого века. Далее, хотя мы и провели критический анализ мягкого разобщения, регулирующего уровень ТМП, указывая на осторожное его использование, мы отдаем себе отчет и признаем, что в ряде случаев такая стратегия показана для лечения критических патологий, прежде всего ассоциированных с состоянием окислительного стресса. В этих целях будут рассмотрены мишени действия разобщителей в митохондриях, включая мягкие разобщители. Для этого предполагается использовать несколько другой методический арсенал, не используемый нами ранее. Мы подвергнем всестороннему анализу недавно открытую нами новую форму биоэнергетики, основанную не на транспорте протона, а иона калия с оценкой роли ТМП в реализации такой энергетики. Все эти моменты объединены общей идеей необходимости гомеостаза митохондрий, и прежде всего их ТМП, для недопущения возникновения патологий.

Коллектив, заявленный в проекте, обладает максимальной в РФ экспертизой в области изучения структуры и функций митохондрий на субклеточном, клеточном, органельном и органном уровне, то есть включает в себя биохимический, цитологический и физиологический уровень. По объективным данным в РФ такой коллектив – единственный и первый по объему проведенных работ в области митохондриологии. Это доказано высочайшим уровнем публикаций и широким признанием в мире, который выражается в одном из самых высоких уровней цитирования работ в РФ, включая руководителя, у которого уровень цитирования по данным Web of Science превышает 11 тысяч. Кроме этого, предыдущие проекты, поддержанных разными фондами, всегда заканчивались успешным выполнением поставленных задач. Этот проект заявлен по причине получения целого ряда предварительных положительных данных. Это касается и роли АТР синтазы в транспорте ионов калия, и участии в мягком разобщении и методических подходов, в частности по работе с одиночными клетками, когда отдельная клетка исследовалась на цитологическим уровне, потом фиксировалась, подвергалась процедуре проводки для электронной микроскопии, после чего находилась в популяции клеток и избирательно исследовалась электронномикроскопическим методом после приготовления ультратонких срезов таргетной клетки. При этом возможна оценка трехмерной ультраструктуры, что было сделано при участии руководителя проекта в прошлом при доказательстве кабельных свойств митохондрий (эта работа, вошедшая в учебники и ставшая классической, была опубликована в 1988 году в J Cell Biol). В коллективе имеется уникальный и очень широкий арсенал самых современных методик, в том числе, самый современный конфокальный микроскоп, позволяющий работать на самом высоком на уровне оптического разрешения, необходимого для избирательной оценки структуры и функций именно митохондрий.

В итоговом результате выполнения работ по проекту основным достижением будет подкрепление концепции об исключительной важности трансмембранного потенциала (ТМП) для митохондрии и клетки. Если на сегодняшний момент считается, что ТМП является движущей силой в виде энергии электрической разности потенциалов в своего рода электрическом моторе, обеспечивающем вращение роторной части АТР синтазного комплекса, то мы дополним эту концепцию. Мы докажем, что кроме этой функции, кстати обеспеченной не только транспортом протона, но и транспортом ионов калия, эта разность электрических потенциалов, создаваемая помпами, сосредоточенными во внутренней мембране митохондрий, может служить поддержкой других насущных клеточных функций. Мы уже ранее предполагали, что природа организовала ориентацию ТМП таким образом, что она термодинамически запрещает транспорт анионов в матрикс митохондрии (включая чужеродные нуклеиновые кислоты), но делает предпочтительным транспорт катионов (включая ионы калия), одновременно обеспечивая функционирование калиевой энергетики. Будет сделан анализ, в чем состоит предпочтение калиевой энергетики перед протонной, и на каких принципах построена регуляция такого транспорта. Будет сделано утверждение, что в пределах имеющейся разности свободной энергии окисления можно будет синтезировать больше молекул АТР в условиях переключения на калиевую энергетику, что важно при активации метаболизма (например, при быстром беге), что означает повышение коэффициента полезного действия при окислении и функционировании калиевой энергетики, однако сопряженные с окислением процессы (например, термогенез) будут заторможены. Мы также подкрепим наши наблюдения, выразившиеся в гипотезе о создании реактивной силы при выбрасывании из митохондрий образованной в результате окисления воды. При этом мы определим, играет ли роль ТМП в этом процессе, или нет, понимая, что полная или частичная элиминация ТМП приведет с одной стороны, к повышению генерации воды в митохондриях, а с другой - вызванное разобщением изменение конфигурации митохондрий может повлиять на распределение мест выброса воды из митохондрии. Мы определим широту допустимого интервала ТМП, который обеспечивает нормальное функционирование клетки, дополнив этим концепцию «мягкого» разобщения окислительного фосфорилирования. Мы укрепим точку зрения, что для разобщения недостаточно лишь одного существования бислойной фосфолипидной мембраны, а необходимо присутствие во внутренней мембране митохондриальных белков, облегчающих транспорт протонов в матрикс. Мы дополним список кандидатов на естественные разобщающие белки, в котором на сегодняшний день имеются транслокатор адениновых нуклеотидов, дикарбоксилатный переносчик и семейство разобщающих белков (UCPs), еще одним белком (вернее, компонентом белкового суперкомплекса), а именно АТР синтазой. Это не просто расширит фундаментальный багаж знаний биоэнергетики, клеточной биологии и физиологии, но и может дать некий стимул для фармакологии и связанной с ней индустрии, которая поможет в развитии направления создания на этой базе лекарственных средств, показанных для лечения широкого круга заболеваний, включающих, прежде всего, ожирение, и патологии, вызванные ишемией . Учитывая обнаруженную достаточно высокую гетерогенность митохондриальных параметров, своими работами мы укрепим и еще больше обоснуем необходимость рассмотрения при любом воздействии, затрагивающем деятельность митохондрий, не усредненных значений ТМП в контроле и опыте, а всей совокупности данных, то есть требуется оценка популяционного распределения с надлежащим анализом, обычно применимым для популяций. Популяционный анализ позволит применить эту концепцию к принципам персонализированной митохондриальной медицины. Основным индикатором, по которому будет проведен популяционный анализ, будет ТМП митохондрий.