![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
У грызунов, постоянно живущих под землей, существует ряд механизмов для адаптации к длительному недостатку кислорода, связанный с соответствующими мутациями в регулирующих метаболизм генах. Примером вида, у которого такая адаптация привела к уникальным сверхкомпенсаторным изменениям, является голый землекоп Heterocephalus glaber. Имея физические размеры, сравнимые с мышью, голые землекопы живут на порядок дольше, и считается, что они относительно редко развивают злокачественные опухоли. Кроме того, это единственные известные млекопитающие, не поддерживающие постоянную температуру тела в активном состоянии. Пониженная температура тела и усиленный контроль клеточного деления могут негативно сказываться на эффективности иммунного ответа, особенно адаптивного, однако, H. glaber, по-видимому, относительно устойчивы к инфекционным заболеваниям и хорошо чувствуют себя в конвенциальных условиях содержания. Развитию и функционированию иммунной системы H. glaber, о которой имеются лишь отрывочные устаревшие сведения, и посвящен данный проект. На первом этапе работы основные усилия будут сосредоточены на получении и подборе необходимых иммунологических реагентов с использованием стандартных приемов молекулярной иммунологии, в том числе гибридомной технологии, а также биоинформатики. Полученные панели антител будут использованы для изучения развития первичных и вторичных лимфоидных органов H. glaber в процессе онтогенеза, а также для изучения параметров иммунного ответа этих животных на различные антигены. Кроме того, первичные культуры клеток гематопоэтического происхождения, полученные из H. glaber, будут сопоставлены с соответствующими первичными мышиными культурами по индексу пролиферации, уровню АФК, чувствительности к индукторам апоптоза и другим параметрам.
The rodents that live permanently underground have certain mechanisms to adapt to prolonged lack of oxygen associated with the corresponding mutations in genes regulating metabolism. Naked mole rat Heterocephalus glaber is an example of this adaptation, leading to unique changes. Naked mole rats have a physical size comparable to a mouse, but live much longer, and it is believed that they are relatively rarely develop a malignant tumor. It is also the only known mammals that do not support a constant body temperature in an active state. The decreased body temperature and increased control of cell division can have a negative impact on the effectiveness of the immune response, particularly adaptive, however, H. glaber appears to be relatively resistant to infectious diseases and feel good in the conventional conditions. This project is dedicated to the development and functioning of the immune system of H. glaber. On the first stage main efforts will be focused on getting and selecting the necessary immunological reagents using standard methods of molecular immunology including hybridoma technology and bioinformatics. The resulting panels of antibodies are used to study the development of primary and secondary lymphoid organs of H. glaber in the process of ontogenesis, and also to study the immune response of these animals to various antigens. In addition, primary cultures of cells of hematopoietic origin derived from H. glaber, will be compared with the corresponding primary murine cultures on the index of proliferation, ROS levels, sensitivity to inducers of apoptosis and other parameters.
Будет получено морфологическое и гистологическое описание органов иммунной системы молодых рабочих особей голого землекопа. Будет описана динамика созревания Т-лимфоцитов в тимусе. Будут получены моноклональные антитела, реагирующие с лимфоцитами землекопа. Будут отобраны клоны антител, которые при тестировании методом проточной цитометрии будут давать уникальные гистограммы флуоресценции. Полученные антитела будут наработаны в препаративных количествах и будут мечены различными флуорофорами.
Участники творческого коллектива имеют публикациии мирового уровня в области иммунологии и клеточного старения, а также опыт совместных исследований физиологических систем грызунов, включая иммунную (Муфазалов, И.А., Пеньков, Д.Н, Черняк, Б.И., Плетюшкина, О.Ю., Высоких, М.Ю., Черткова, Р.В., Кирпичников, М.П., Долгих, Д.А., Круглов, А.А., Купраш, Д.В., Скулачев, В.П., Недоспасов, С.А. Эмбриональные фибробласты мыши с мутацией K72W в гене соматического цитохрома С: получение и характеристика. Мол. Биол. 2009, т. 43 (4), 648-656). В настоящее время в распоряжении коллектива имеется колония H. glaber размером 25 особей (королева и два мужа, остальные животные - их потомки), находящаяся в НИИФХБ Белозерского в термостатируемом боксе, в камерах с удаленным контролем температуры и влажности и двумя видеокамерами в инфракрасном диапазоне (http://vsb.fbb.msu.ru/molerat/). Для культивирования клеток H. glaber собрана система с CO2 инкубатором с возможностью понижения концентрации кислорода за счет замены его азотом. Проводятся пилотные эксперименты по изучению свойств фибробластов, полученных из различных органов H. glaber (V.P. Skulachev, S. Holtze, M.Y. Vyssokikh, et al. Neoteny and Physiological Phenomena of Delay of the Aging Program: From Naked Mole Rats to “Naked Apes” (Humans). Physiological Reviews, на ревизии). Имеется полный спектр клеточного и биохимического оборудования для запланированных экспериментов.
Проект позволит охарактеризовать иммунную систему голого землекопа. В ходе проекта будет получена панель моноклональных антител против основных маркеров лимфоцитов H. glaber. Мы предполагаем, что нами будут получены антитела против таких важных субпопуляционных маркеров как CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20 и CD45. Полученные антитела позволят определять основные субпопуляции лимфоцитов землекопа и таким образом контролировать развитие иммунного ответа этого животного. Антитела будут также пригодны для функционального анализа и выделения соответствующих субпопуляций. Будут получены и исследованы культуры гематопоэтических клеток in vitro, а также параметры иммунного ответа на модельный антиген in vivo.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 6 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Особенности онтогенеза иммунной системы голого землекопа, самого долгоживущего грызуна |
Результаты этапа: Получены генетические конструкции для экспрессии генов, кодирующих маркеры иммунных клеток голого землекопа (CD3e, CD3d, CD4, CD20, CD25, CD45, CD62L, CD69) и последующей иммунизации животных с целью получения гибридом. Отработан протокол получения клеточных линий, экспрессирующих молекулу CD4 голого землекопа, которые могут быть использованы для иммунизации мышей. Среди коммерческих антител против белков мыши и человека найдены антитела, распознающие клетки селезенки, крови и костного мозга голого землекопа: моноклональное антитело TM1, распознающее поверхностный антиген CD14, моноклональное антитело AC136, распознающее поверхностный антиген CD34, моноклональное антитело M1/70, распознающее поверхностный антиген CD11b (интегрин альфа-M). Получены первичные культуры клеток костного мозга голого землекопа с использованием среды, содержащей ростовой фактор M-CSF мыши. Выявлено высокое содержание клеток со спонтанными цитогенетическими нарушениями (микроядрами) в периферической крови голого землекопа. | ||
2 | 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. | Особенности онтогенеза иммунной системы голого землекопа, самого долгоживущего грызуна |
Результаты этапа: При помощи панели кросс-специфических антител против миелоидных маркеров голого землекопа были охарактеризованы первичные и вторичные лимфоидные органы голых землекопов по сравнению с лабораторными мышами C57Bl6 при цитофлуориметрическом анализе. У голого землекопа обнаружено более низкое содержание иммунных клеток костного мозга и селезенки, при этом относительное содержание миелоидных клеток в этих органах было выше. Первичные культуры клеток костного мозга голого землекопа, полученные при температуре 32 С, на 7 день характеризуются большим количеством клеток, обладающих морфологией макрофагов, чем клетки, культивируемые при 37 С. После активации LPS, в макрофагах костного мозга голого землекопа наблюдается увеличение экспрессии генов Tnf на уровне, сопоставимом с активированными клетками мыши. При культивировании костномозговых предшественников голого землекопа в полужидкой среде со смесью ростовых факторов человека при 32 С формируется больше гранулоцитарно-миелоидных колоний, чем при 37 С. У мыши количество колоний, получаемых из равного количества предшественников, не зависит от температуры. В культуре клеток подкожных фибробластов голого землекопа в нормальных условиях выше содержание аутофагосом, а также выше доля аутофагосом, ко-локализованных с митохондриями по сравнению с мышью и человеком. Повышение уровня ко-локализации при окислительном стрессе, индуцируемом добавлением к клеткам пероксида водорода, в культуре фибробластов голого землекопа выражено меньше при 33 С, чем в культурах мыши и человека при стандартных условиях. | ||
3 | 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. | Особенности онтогенеза иммунной системы голого землекопа, самого долгоживущего грызуна |
Результаты этапа: В ходе проекта была дана общая характеристика состава иммунной системы голого землекопа. Была описана панель кросс-специфических антител, распознающих различные иммунные клетки голого землекопа (гемопоэтические, миелоидные клетки, цитотоксические лимфоциты). При помощи данной панели антител методом проточной цитофлуориметрии были охарактеризованы первичные и вторичные лимфоидные органы молодых половозрелых голых землекопов по сравнению с лабораторными мышами C57Bl6. У голого землекопа было обнаружено достоверно более низкое содержание иммуноцитов костного мозга и селезенки, при этом относительная представленность популяции миелоидных клеток в этих органах была выше, по сравнению с мышью. Было показано, что рекомбинантные факторы роста гемопоэтических клеток человека и мыши способны поддерживать рост и дифференциацию клеток костного мозга голого землекопа, однако только при физиологически релевантной для голого землекопа температуре – 32С. Было показано, что первичные культуры клеток костного мозга голого землекопа, культивируемые в присутствие ростового фактора rm-M-CSF обладают морфологией макрофагов. Поляризация макрофагов голого землекопа в воспалительных и противовоспалительных условиях приводит к увеличению экспрессии цитокинов и соответствующих фенотипу маркеров по сравнению с неактивированными клетками. Была разработана стратегия получения моноклональных антител к маркерам Т-хелперов и В-клеток голого землекопа. Мыши были иммунизированы клетками линии HEK293, сверхэкспрессирующими поверхностный белок CD4 голого землекопа. В дальнейшем наличие в сыворотке мышей поликлональных антител, способных распознавать как антиген на поверхности клеток HEK293, использованных для иммунизации, так и антиген на спленоцитах голого землекопа, было верифицировано при помощи проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".