ИСТИНА

Проект направлен на изучение роли экзосом - покрытых бислойной мембраной микрочастиц, которые являются медиаторами межклеточной коммуникации, - в транспорте протеасом из клеток во внеклеточное пространство с целью определения функций последних вне клетки, понимание которых в будущем откроет перед нами перспективы в использовании внеклеточных протеасом в клинике не только в качестве диагностических и(или) прогностических маркеров, но также в качестве терапевтических мишеней. В рамках проекта запланировано создание клеточной линии на основе клеток человека HeLa, стабильно экспрессирующей меченную зеленым флуоресцентным белком протеасомную субъединицу beta7 и слитый с красным флуоресцентным белком маркер экзосом – тетраспанин CD63 (HeLa beta7-GFP/CD63-RFP). Будет произведена прижизненная интервальная фотосъемка транспорта протеасом в экзосомах клетками HeLa beta7-GFP/CD63-RFP во внеклеточное пространство с помощью флуоресцентной микроскопии (техника timelapse). Далее будет разработан подход для аффинной очистки экзосом из среды культивирования клеток человека на основе модифицированного маркера экзосом CD9, слитого с полипептидом HTBH. Белковый состав или протеом аффинно-очищенных экзосом будет проанализирован с помощью MALDI FT-ICR масс-спектрометрии с последующим подтверждением результатов вестерн-блотингом со специфическими антителами к протеасомным белкам. В заключение запланирован структурно-функциональный анализ протеасом в составе аффинно-очищенных экзосом. Полученные в ходе исследования данные позволят приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования и биологической роли внеклеточных протеасом, а также управлению их активностью с целью достижения терапевтического эффекта при различных патологиях.