Изучение структуры и механизма функционирования натрий-транслоцирующей NАDН:хинон оксидоредуктазыНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 12 марта 2013 г.-31 декабря 2013 г. Изучение структуры и механизма функционирования натрий-транслоцирующей NАDН:хинон оксидоредуктазы
Результаты этапа: Na+-транслоцирующая NADH:хинон оксидоредуктаза (Na+-NQR) содержит в качестве редокс-активных простетических групп два остатка FMN, присоединенных фосфоэфирной связью к остаткам треонина субъединиц NqrB и NqrC. В ходе выполнения проекта обнаружено, что гены apbE, кодирующие белок с ранее неизвестной функцией, кластеризуются в бактериальных геномах с генами для Na+-NQR и других FMN-связывающих флавопротеинов, что указывает на возможность участия продукта этих генов в пришивании остатка FMN к этим флавопротеинам. Показано, что для флавинилирования укороченной субъединицы NqrC из фермента Vibrio harveyi по остатку Thr229 в клетках Escherichia coli необходима коэкспрессия гена apbE. Эксперименты с изолированными белками NqrC и ApbE подтвердили заключение, что ApbE – единственный белковый фактор, необходимый для флавинилирования NqrC. Эти эксперименты также выявили зависимость данной реакции флавинилирования от ионов Mg2+ и установили, что в качестве источника флавина выступает FAD, но не FMN. Показано, что инактивация гена apbE в клетках Klebsiella pneumoniae приводит к полному исчезновению хинон редуктазной активности Na+-NQR, что согласуется с известной ролью остатков FMN в осуществлении этой активности. Таким образом, полученные в ходе выполнения проекта результаты позволяют идентифицировать белок ApbE в качестве нового модифицирующего фермента – флавин трансферазы.
2 12 марта 2014 г.-31 декабря 2014 г. Изучение структуры и механизма функционирования натрий-транслоцирующей NАDН:хинон оксидоредуктазы
Результаты этапа: Геном энтеробактерии Klebsiella pneumoniae содержит гены для двух разных флавинтрансфераз (ApbE1 и ApbE2), ковалентно пришивающих остатки FMN к остаткам треонинов в белках. В аминокислотной последовательности ApbE1, в отличие от ApbE2, присутствует сигнальный пептид, направляющий этот белок в периплазму. Геном K. pneumoniae также содержит гены по крайней мере для трех предположительных мишеней для ковалентного присоединения FMN, содержащих мотив для флавинилирования Dxx(s/t)gAT: две субъединицы Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы (Na+-NQR) и 99,5 кДа белок (KPK_2907) с неустановленной функцией. В ходе данной работы показано, что KPK_2907 является цитоплазматической фумаратредуктазой. Инактивация гена kpk_2907 в клетках K. pneumoniae приводила к потере цитоплазматической фумаратредуктазной активности, однако эта мутация не влияла на фумаратредуктазную активность в мембранной фракции. Комплементация данного мутантного штамма kpk_2907-содержащей плазмидой сопровождалась полным восстановлением цитоплазматической фумаратредуктазной активности. Показано, что гетерологически продуцированный в клетках Escherichia coli белок KPK_2907 содержит ковалентно связанный остаток FMN, нековалентно связанный FMN и нековалентно связанный FAD с соотношением 1 моль/моль белка для каждого из этих трех флавинов. Мутация по гену apbE1 в K. pneumoniae приводила к инактивации Na+- NQR, не влияя на активность цитоплазматической фумаратредуктазы. В то же время, мутация по гену apbE2 инактивировала фумаратредуктазную активность, но не активность Na+-NQR. Обе эти активности могли быть восстановлены трансформацией apbE1 - или apbE2-мутантных штаммов K. pneumoniae плазмидой, несущей apbE ген из Vibrio cholerae, кодирующий белок, содержащий, или не содержащий периплазматическую сигнальную последовательность, соответственно. Таким образом, наши данные показывают, что ApbE1 и ApbE2 пришивают остаток FMN к Na+-NQR и фумаратредуктазе, соответственно. Также полученные данные означают, что ковалентно связанные остатки FMN находятся в периплазматической части Na+-NQR, что находится в полном противоречии с ранее принятой точкой зрения. В соответствии с новыми данными предложен новый механизм генерации натриевого потенциала Na+-NQR, получивший название “электронной петли” и включающий в себя стадию Na+/электрон-симпорта.
3 12 марта 2015 г.-31 декабря 2015 г. Изучение структуры и механизма функционирования натрий-транслоцирующей NАDН:хинон оксидоредуктазы
Результаты этапа: Исходя из анализа трехмерной структуры NqrC, были определены аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии этого белка с изоаллоксазиновым кольцом FMN. С помощью сайт-специфического мутагенеза были произведены следующие замены этих аминокислотных остатков: L149G, W150A, T177A, L180D и T231A. Полученные мутантные формы NqrC были наработаны в клетках E. coli в присутствии флавин трансферазы ApbE и выделены с использованием аффинной хроматографии. Были определены различные параметры связывания флавина с этими мутантными формами. Показано, что все сделанные мутации не влияют на степень флавинилирования, во всех случаях содержание голоNqrC в препаратах было близко к 100%. Мутации L149G, T177A, L180D и T231A хоть и приводили к увеличению флуоресценции нативных форм соответствующих форм NqrC, однако лишь в незначительной степени. В то же время, W150A форма NqrC демонстрировала очень высокий уровень флуоресценции, сравнимый с таковым у флавинов в растворе. Показано, что данная мутация увеличивает уровень флавиновой флуоресценции приблизительно в 60 раз. Таким образом, полученная мутантная форма NqrC может быть использована в наших дальнейших попытках применения ApbE/NqrC системы для визуализации различных биологических процессов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".