ИСТИНА

Потепление климата, связанное с ростом концентрации парниковых газов в атмосфере, представляет насущную проблему современности. Природная эмиссия СO2 при минерализации растительных остатков (60 Гт С/год), основу которых составляет лигноцеллюлоза, многократно превышает эмиссию, вызванную антропогенной деятельностью (9 Гт С/год). Основными механизмами стабилизации биомолекул органических остатков в аэробных условиях являются гумификация и органо-минеральные взаимодействия, в почвах эти процессы во многом взаимосвязаны. Накопление устойчивых соединений почвенного гумуса (1-2 Гт С/год)обеспечивает долговременный (тысячелетия) вывод углерода из биологического круговорота,регулирует газовый состав атмосферы, способствует накоплению кислорода и является необходимым условием аэробной жизни. Гумус составляет главный резервуар Сорг в биосфере (1500 Гт), с ним связано появление почв как плодородного слоя, становление наземных экосистем и их дальнейшая эволюция. Рост глобальных температур и аридизация способствуют биодеградации гумуса, что может быть особенно ощутимо для экосистем холодного гумидного климата (почвы тундр, бореальных лесов, включая торфяники), в которых сосредоточено около 40% запасов Сорг почв планеты, 80% запасов углерода торфов и большая часть углерода почв России. Изучение биохимических процессов, регулирующих естественный баланс потоков CO2 между почвой и атмосферой, является актуальной задачей, решение которой необходимо для прогнозов эмиссий парниковых газов, разработки стратегий устойчивого землепользования,способствующих переводу углерода из активного пула в пассивный. Проект направлен на установление роли грибных фенолоксидаз – лакказ, в образовании и трансформации гуминовых веществ (ГВ) – темноокрашенных продуктов гумификации, составляющих основу гумуса. В проекте будет использован уникальный комплексный подход заключающийся в привлечении методов биохимии и молекулярной биологии к решению проблемы гумификации, масштаб которой определяется геологическим отрезком времени и экосистемным охватом – от появления первых темноокрашенных веществ ароматической природы (не менее 1 млрд лет назад) до современных почв тундровых, лесных и травянистых экосистем. Будет проведено моделирование реакций синтеза и трансформации ГВ в присутствие широко распространенного в почвах фермента лакказы, катализирующего как образование, так и разрыв ковалентных связей в фенольных субстратах за счет молекулярного кислорода. Лакказа продуцируется бактериями, лигнолитическими базидиальными грибами, микромицетами, а также,как установлено авторами проекта, автотрофными симбиотическими организмами – лишайниками.Лишайники составляют доминирующий покров 6% поверхности суши (тундры, высокогорья, сосняки-беломошники) и являются организмами-пионерами на минеральных субстратах, играя важнейшую роль в первичном почвообразовании. Современные почвы под лишайниками авторами проекта предлагается рассматривать как актуалистическую модель древней долигниновой биосферы. Лакказа у лишайников обладает необычной олигомерной структурой и сохраняет активность внутри воздушно-сухих талломов в течение многих лет при комнатной температуре, по нашим предварительным данным стабильность зависит от связывания с неизвестными компонентами лишайника. Для всестороннего решения проблемы участия лакказ в гумификации планируются следующие направления исследований: 1) изучение каталитической активности фермента в почвах различных экосистем – от тундры до степей, изучение параметров адсорбции лакказы минеральными фазами и влияния этого процесса на свойства фермента;.2) развитие предложенной авторами концепции гетерогенного биокатализа как приоритетного механизма образования ГВ из мономерных предшественников - моделирование конденсационных реакций в присутствие иммобилизованных лакказ в динамическом режиме, имитирующем почвенные соотношения твердой и жидкой фаз и концентрации растворенных веществ – предшественников;3) изучение деполимеризующей способности лакказ почвенных грибов и лишайников в отношении выделенных из почв гумусовых веществ: выявление особенностей их трансформации лакказамипо сравнению с лигнолитическими пероксидазами и целлюлазами, изучение устойчивостимакромолекулярных фрагментов ГВ к перечисленным ферментам, действующим на С-С и С-Oсвязи; 4) изучение возможности участия лакказ в гумификации в различные периодыгеологической истории Земли путем секвенирования генов лакказ у лишайников и сравнения сопубликованными геномами лакказ свободноживущих грибов; 5) изучение физико-химическихсвойств и трехмерной структуры (после кристаллизации) лакказ пельтигеровых лишайников по сравнению с лакказами свободноживущих грибов; исследование природы веществ, стабилизирующих и модифицирующих лакказу и влияющих на ее функционирование внутри и внеталломов. Предполагается, что исследования внесут весомый вклад в решение фундаментальных и прикладных проблем почвоведения, биогеохимии и биохимии. Планируемые эксперименты позволят сделать вывод о роли биокатализаторов, свободнорадикальных реакций и ковалентныхвзаимодействий в образовании и молекулярной организации веществ гумуса, позволят подтвердить или опровергнуть возможность новообразования ГВ как специфических почвенных соединений, а также расширят представления о реакционной способности и биосферных функциях лакказ – наиболее распространенных окислительных ферментов цикла углерода. Впервые будет исследована роль лакказ почвенных микромицетов и лишайников в гумификации. У этих организмов лакказа является главным ферментом лигнолитического комплекса, что предполагает ее важную роль в секвестрации органического углерода как в историческом аспекте (синтез и деструкция ГВ до появления лигнина и разрушающих его грибов, 400 млн лет назад), так и в современных почвах, когда ограничена активность лигнолитических пероксидаз – основных катализаторов деструкции фенольных полимеров. Впервые будут исследованы гены и структура лакказ симбиотических автотрофных организмов, проведено сравнение с генами и структурой лакказ свободноживущих органотрофных грибов. Это внесет большой вклад в представления о функционирования фермента у разных продуцентов, его структуре, происхождении и эволюции. Планируемые исследования являются абсолютно новым подходом к проблеме и опережают мировой уровень.

Climate warming associated with increasing greenhouse gas concentrations in the atmosphere is the vital problem of our time. Natural emission of CO2 by mineralization of lignocellulosic plant residues (60 GT C/year) is many times higher than emission due to anthropogenic activities (9 GT C/year). Humification and organo-mineral interactions are the main stabilization mechanisms of plant-derived carbon under aerobic conditions. These processes are largely interrelated in soils. Accumulation of recalcitrant compounds of soil humus (1-2 GT C/year) provides long-time (thousands of years) sink of CO2 and contributes to oxygen accumulation in the atmosphere. Humus is a major reservoir of SOC in the biosphere (1500 GT). It forms the basis for terrestrial life, marks the appearance of soils as a fertile layer, is vital for the establishment of terrestrial ecosystems and their future evolution. The rise of global mean temperatures and increasing aridity contribute to biodegradation of humus. Mineralization process can be especially noticeable in cold humid climate (soils of tundra, boreal forests, including peat), which holds about 40% of the soil reserves of Corg of the planet, 80% of the peat C and most of the carbon in soils of Russia. The study of biochemical processes regulating the natural fluxes of CO2 between soils and atmosphere, is an actual task of our days, because knowledge of these processes enables projections of greenhouse gas emissions, and allow to develop strategies for sustainable land use, facilitating transfer of carbon from active pool to the passive. The aim of the project is to establish the role of fungal phenoloxidase – laccases, in the formation and transformation of humic substances (HS) – dark-colored products of humification, major components of humus. A unique integrated approach combining methods of soil science, biochemistry and molecular biology will be used to address the problem of humification. The scope of the task is defined by geological time interval and ecosystem scale – from the emergence of the first dark-colored substances of aromatic nature (at least 1 billion years ago) to the modern soils of tundra, forest and steppe ecosystems. We will model the reactions of synthesis and transformation of HS in the presence of widespread soils enzyme laccase which catalyses both formation and destruction of covalent bonds in phenolic substrates in presence of molecular oxygen. Laccase is produced by bacteria, ligninolytic basidiomycetes, cellulolytic micromycetes and by symbiotic autotrophic organisms – lichens as well. Lichens form the dominant cover of 6% of the land surface (tundra, high mountains, pine forests) and are the pioneer organisms on mineral substrates, playing a crucial role in initial soil formation. We are suggesting that modern soils under lichen communities can be considered as actualistic model of ancient pre-lignin biosphere. Laccase in lichens is unusual by its oligomeric structure as well as ability of long-time (several years) maintainance of activity inside the thalli at room temperature. According to our preliminary data, the stability depends on binding with unknown components of the lichen. In order to establish the role of laccase in humification the following research will be done: 1) study of catalytic activity of the enzyme in soils of different ecosystems – from tundra to steppes, study of the parameters of the adsorption of laccase by mineral phases and the effects of this process on the properties of the enzyme;.2) development of heterogeneous biocatalysis concept proposed by the authors: modelling condensation of monomers in the presence of immobilized laccase in a dynamic mode, simulating the soil conditions with respect to the ratio of solid and liquid phases and the concentration of dissolved precursor substances; 3) study of depolimerizing ability of soil fungi and lichens in relation to HS isolated from soils: identifying features of their transformation by laccase in comparison with manganese-dependent peroxidase and cellulase, study of the stability of macromolecular fragments of HS to the mentioned enzymes acting on C-C and C-O bonds; 4) study of the laccase potential participation in humification in different periods of the geological history of the Earth Заявка № 17-14-01207 Страница 4 из 51 by sequencing of laccase genes from lichens and comparison with published genomes of free-living fungi; 5) study of physicochemical properties and three-dimensional structures (after crystallisation) of laccases from peltigerous lichens and comparing with published data on free-living fungi; study of the nature of substances, stabilizing and modifying lichens laccase and affecting its functioning inside and outside the thalli. It is expected that the research will contribute significantly to fundamental and applied problems in soil science, biogeochemistry and biochemistry. The results will allow to make a conclusion about the role of biocatalysts, the free radical reactions and covalent interactions in the formation and molecular organization of the humic substances, will allow to confirm or not the possibility of synthesis of HS as specific soil compounds as well as enhance our understanding of the reactivity and biospheric functions of laccases – the most common oxidizing enzymes of the carbon cycle. For the first time the role of micromycete-derived laccase in humification will be investigated. Laccase of these organisms lacking ligninolytic peroxidases is the major ligninolytic enzyme. This suggests important role of laccase in sequestration of organic carbon in historical perspective (synthesis and degradation of HS before the after appearance of lignin and its decomposing fungi 400 million years ago) as well as in modern soils when ligninolytic peroxidases activity is limited. Laccase genes will be investigated for the first time. The structure of laccases of these symbiotic autotrophic organisms will be compared with the genes and the structure of laccases of free-living organotrophic fungi. This will make a significant contribution to the understanding of the functioning of the enzyme from different producers, enzyme structure, origin and evolution. Overall, the project will use completely new approach to the humification problem and goes significantly ahead of the world level.

В ходе выполнения работ в рамках проекта предполагается получение следующих основных результатов. 1) Будет определена каталитическая активность лакказы в почвах различных экосистем – от тундры до степей, установлены особенности функционирования фермента при адсорбции минеральными фазами 2) Впервые будет установлена принципиальная возможность новообразования темноокрашенных гетерополимеров при воздействии иммобилизованных на минералах лакказ на мономерные соединения-предшественники в динамическом проточном режиме, имитирующем почвенные условия, включая соотношения твердой и жидкой фаз и низкие концентрации растворенных веществ 3) Будет определена молекулярная устойчивость экстрагируемых щелочью полимерных веществ гумуса к важнейшим ферментам гумификации, действующим на ковалентные связи фенольных и углеводных фрагментов – лакказе, лигнолитической пероксидазе, целлюлазе. Впервые будет установлена роль лакказ грибов-целлюлолитиков (к которым относится 80% культивируемого микробного населения почв) в секвестрации органического вещества почв. 4) Впервые будут секвенированы и клонированы гены лакказ лишайников, что позволит оценить правомерность рассмотрения лишайников как реликтовых организмов-гумусообразователей долигниновой биосферы. Впервые будет установлена возможность участия лакказ в гумификации в различные периоды геологической истории Земли. На основе анализа генов свободноживущих и симбиотических грибов будет построено эволюционное древо для лишайниковых лакказ. 5) Будет проведена сравнительная характеристика физико-химических свойств и трехмерной структуры лакказ свободноживущих грибов и лишайников. Впервые будет исследована структура лакказ лишайников, химическая природа веществ лишайников, модифицирующих фермент и влияющих на функционирование внутри и вне талломов. В рамках работы возможно создание новых подходов для хранения ферментных препаратов. 6) Будут сформулированы основные принципы гумификации в присутствие гетерогенных фаз (минералы или грибной мицелий) и лакказы как биокатализатора, показана роль лакказы в конденсационных процессах и ресинтезе гетерополимеров в почвенных условиях, определена возможная деполимеризующая активность лакказ небазидиальных грибов в отношении фенольных субстратов, что существенно расширит представления о функциях фермента в секвестрации углерода в отсутствие лигнолитических пероксидаз (период развития почв до появления лигнина 400 млн лет назад и минеральные горизонты современных почв). Уровень ожидаемых результатов сопоставим с мировым. Более того, по ряду позиций ожидаемые результаты можно назвать опережающими. Помимо научной новизны и интереса для решения фундаментальных проблем почвоведения, биогеохимии и биохимии, комплекс проведенных исследований может быть востребован в социально значимой сфере – для разработки стратегий устойчивого землепользования, способствующих секвенированию углерода в почвах, для прогнозов отклика органического вещества почв на наблюдаемый рост температур и аридизацию,для производства гуминовых удобрений, разработки способов хранения ферментных препаратов, улучшения функционирования лакказы при использовании этого фермента в биотехнологиях.

Доказана возможность образования гумусоподобных веществ в присутствие иммобилизованной лакказы (Zavarzina 2006; 2011). Предложена гипотеза гетерофазного биокатализа (Zavarzina 2011). Изучена активность лакказ и пероксидаз в подзолах и подзолистых почвах лесной зоны. Впервые установлено, что лакказа базидиомицета белой гнили древесины способна к деполимеризации ГК почвы in vitro (Zavarzina et al., 2004) и в погруженной культуре. Обнаружены лакказы и тирозиназы в лишайниках разных систематических групп (Заварзина и Заварзин, 2006), показано, что лакказы обладают необычными свойствами (Lisov et al., 2007, 2012). предложен актуалистический подход к изучению гумусообразования в ранней биосфере (Zavarzina and Zavarzin, 2013). В лишайниках изучены водорастворимые фенольные соединения, установлена корреляция с продукцией лакказ (Загоскина и др 2011; 2013), обнаружены фенолы-дериваты лигнина (Заварзина и др 2015). показано, что лакказы лишайников способны деполимеризовывать почвенные гуминовые вещества in vitro (Lisov et al., 2012). Проведен анализ литературы по исследуемой проблеме, написаны обзоры (Заварзина 2010; Zavarzina 2011; Zavarzina et al 2011; Beckett et al., 2013). Разработаны подходы и методы к изучению роли окислительных ферментов в гумификации (Zavarzina 2006; Zavarzina et al 2004),Разработан метод вещественного анализа почв, илов и донных отложений в динамическом режиме во вращающихся спиральных колонках (Fedotov et al., 2002). Разработан способ получения лакказ лишайников (Lisov et al. 2012). Исследованы лакказы дереворазрушающих грибов (Lisova et al. 2010), производилось исследование бактериальных лакказ, в том числе рекомбинантных (Lisov et al 2015). авторы проводили исследования трёхмерной структуры лакказ различных организмов (Tishchenko et al 2015). Разработаны методы получения, определения активности, а также создания рекомбинантных продуцентов глюкогидролаз бактерий и дереворазрушающих грибов (Lisov et al 2014, Belova et al 2014).

Проект был направлен на решение масштабной проблемы почвоведения и биогеохимии, связанной с образованием, молекулярной устойчивостью и трансформацией темноокрашенных полифенольных соединений гумуса - гуминовых кислот (ГК), являющихся продуктом деструкции растительных остатков и составляющих 50-70% почвенного гумуса. Процесс гумификации является вторым по масштабу после фотосинтеза, определяет углеродный баланс экосистем, однако пути преобразования органических остатков в гумус до сих пор не установлены, макромолекулярная структура ГК является предметом дискуссий (Piccolo 2001; Sutton and Sposito, 2005), подвергается сомнению факт их биохимической устойчивости (von Lutzow et al, 2006), существования как отдельного класса природных геомолекул и возможность образования в результате окислительной конденсации в почвах (Lehmann and Kleber, 2015). Оригинальным подходом к проблеме гумификации стало моделирование реакций синтеза и деструкции ГК в присутствии лакказы. Лакказа, катализирующая окисление фенольных субстратов молекулярным кислородом, является удобным инструментом для установления молекулярной структуры ГК, их устойчивости и процессов образования. Фермент катализирует конденсацию и деполимеризацию фенольных субстратов по свободнорадикальному механизму с образованием или разрывом ковалентных связей и широко распространена в почвах - продуцируется базидиомицетами, микромицетами, лишайниками и бактериями. Фермент бактерий эволюционно более древний, чем фермент грибов. Таким образом, изучение лакказ различных продуцентов и их взаимодействия с ГК и их предшественниками позволяет изучить биохимическую природу и молекулярную структуру ГК и проследить роль фермента в гумусообразовании в эволюционном аспекте и геологическом масштабе времени. Для установления роли лакказ в деградации ГК проведены реакции их взаимодействия с лакказами и другими оксидоредуктазами почвенных базидиомицетов, аскомицетов и бактерий, в том числе в целлюлолитических условиях (впервые). Возможность синтеза полимерных фракций ГК из мономеров была впервые изучена в динамическом проточном режиме, характерном для почв гумидного климата, при почвенных концентрациях субстратов и активностях лакказы. Впервые исследованы гены лакказ лишайников как предполагаемых древних продуцентов фермента, изучены механизмы взаимодействия ГК с лакказой на основе анализа трехмерных структур ферментов грибов и бактерий. Привлечение методов биохимии и молекулярной биологии к проблеме гумификации позволило получить данные, не имеющие аналогов в мировых исследованиях и существенно дополняющие представления о механизмах образования ГК, их структуре и устойчивости. В результате проведенных в ходе выполнения проекта работ, можно утверждать, что вещества щелочных экстрактов из почв, осаждаемые кислотой (гуминовые кислоты) и составляющие до 50% Сорг, содержат высокомолекулярные полифенольные компоненты, деполимеризующиеся под воздействием окислительных ферментов, действующих на ковалентные связи в фенольных субстратах. Это опровергает мнение о сугубо низкомолекулярной природе почвенного ОВ (Piccolo et al., 2001; 2018). Установлено, что вещества щелочных экстрактов биохимически неустойчивы и подвергаются окислительной деструкции в присутствии окислительных ферментов грибов как в лигнолитических, так и в целлюлолитических условиях, в присутствии ферментов с относительно низким редокс потенциалом (лакказы). Это не согласуется с классическими представлениями о высокой молекулярной устойчивости ГК и их селективном накоплении в почвах (Stevenson, 1994; Орлов, 1990). На примере изучения лакказ широкого ряда продуцентов – дереворазрушающих и подстилочных грибов, аскомицетов, лишайников, бактерий, доказана важная роль фермента лакказы в деградации и синтезе ароматических веществ почвенного гумуса. Показано, что деградация ГК (обесцвечивание и деполимеризация) свойственна в основном лакказам базидиомицетов, происходит при кислых значениях рН и наиболее активно в культурах грибов, а не препаратами ферментов. Впервые установлена возможность эффективной деградации ГК в целлюлолитических условиях за счет действия окислительного фермента целлобиозо дегидрогеназы (ЦДГ), катализирующего окисление целлобиозы хинонами или кислородом с образованием гидрохинонов и перекиси. Доказана роль радикалов и реакции Фентона, запускаемой ЦДГ, в деградации ГК. Эта реакция может повсеместно протекать в почвах, поэтому полученные данные расширяют наши представления о функциях грибов-продуцентов фермента и о деградации ГК грибами. Установлено взаимное влияние лакказы и ЦДГ при деструкции ГК в целлюлолитических условиях – ЦДГ снижала полимеризующее действие лакказы, а лакказа снижала деполимеризующее действие ЦДГ. Особый интерес представляют лакказы аскомицетов и бактерий, т.к. эти организмы не продуцируют линолитических пероксидаз и лакказы у них являются единственным ферментом так называемого “лигнолитического комплекса”. Кроме того, ферменты этих организмов эволюционно более ранние, чем дереворазрушающих грибов, поэтому их участие в гумификации представляет интерес в эволюционном аспекте. Для почвенных микромицетов, выделенных из широкого ряда почв, показана продукция лакказы на агаризованных средах и способность к обесцвечиванию ГК. Однако, способность к обесцвечиванию не всегда коррелировала с продукцией лакказы, поэтому однозначного вывода о роли этого фермента в деградации ГК аскомицетами сделать не удалось и требуются дальнейшие исследования. Впервые изучена трансформация ГК эволюционно древней формой лакказы – двухдоменной лакказой бактерий рода Streptomyces, повсеместно распространенных в почвах. Эти лакказы необычны щелочным рН оптимумом окисления фенольных субстратов, термостабильностью и устойчивостью к ингибиторам. Установлено, что при щелочных рН происходит только полимеризация ГК и их фракций. Без фермента полимеризации ГК в щелочных условиях не наблюдали, что свидетельствует о том, что даже в щелочных условиях процесс полимеризации каталитический и что высокомолекулярные компоненты щелочных экстрактов из почв не являются артефактом экстракции. Особый интерес в плане первичного гумусообразования представляют лишайники как пионеры на минеральных субстратах, организмы-продуценты лакказ (Zavarzina and Zavarzin, 2006) и растворимых фенольных соединений (Загоскина и др., 2013, Zavarzina et al., 2018). Лакказы лишайников необычны наличием двух форм фермента – мономерной и олигомерной, способной трансформироваться в мономерную (Lisov et al., 2007, 2012). Проведены работы по очистке и характеристике лакказ цианолишайников, установлено, что в структуру олигомерной формы модифицируют алифатические соединения. Установлено, что лакказы лишайников полимеризовали ГК и фенольные кислоты in vitro. Из этого следует потенциально важная роль лакказ этих продуцентов в окислительных конденсационных процессах синтеза веществ гумуса. Косвенным свидетельством ранней эволюции лакказ у лишайников являются данные полногеномного секвенирования талломов двух лишайников порядка Peltigerale, и изучения генов лакказ, что явилось долгой и трудоемкой работой, не имеющей аналогов в мировых исследованиях. Впервые секвенированы и клонированы гены лакказ двух пельтигеровых лишайников, показано, что гены лакказ лишайников эволюционно далеко отстоят от генов лакказ наиболее близких грибов-аскомицетов, давно обособились от них и эволюционировали независимо. Впервые построена модель взаимодействия ГК и фенольных соединений с лакказой, на основе получения кристаллов и изучения трехмерных структур трехдоменной лакказы гриба и двухдоменных лакказ бактерий. Установлено, что организация T1 центра лакказ, отвечающая за связывание фермента с субстратом, сходна у обоих форм фермента. На основе анализа окружения Т1 центра установлено, что размер молекул, которые могут подходить к активному центру лакказы и непосредственно с ним взаимодействовать не должен превышать 10 А. Для ГК опубликованы гораздо большие размеры - от 20 до 100 А (Stevenson, 1994). Однако, и высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции ГК окисляются лакказами (Lisov et al., 2018; Zavarzina et al., 2018). Видимо, в ГК существуют структуры, размер которых не превышает 10 А, за счёт окисления которых и происходит трансформация гуминовых веществ лакказами. Трансформация (деградация) компонентов ГК размером > 10 А возможна за счет активных форм кислорода, генерируемых лакказами в гидрохинон редокс цикле (Gomez-Toribio et al., 2009). На основе уникального подхода, заключающегося в моделировании реакций гумификации в проточном режиме при характерных для почв концентрациях субстратов и уровнях активности ферментов (активность лакказы была измерена в профилях широкого ряда почв), установлены ограничения для конденсационных процессов в почвах. Такими ограничениями являются низкие концентрации субстрата и сорбционные взаимодействия с минералами. В результате конденсация останавливается на стадии образования димеров. Полимеризация возможна при локально высоких концентрациях субстратов и застойном режиме. Установлено, что в гетерогенных системах в присутствие лакказы намного более глубоко протекают реакции окислительной трансформации фенольных субстратов, чем в гомогенных системах за счет сорбции продуктов реакции и смещения равновесия реакции в сторону образования продуктов. В результате, в присутствие лакказы происходит эффективная секвестрация ароматических соединений на минеральной фазе, что способствует накоплению ароматического углерода в почвах. На примере реакций феруловой кислоты с отмытым и разрушенным грибным мицелием, показано, что мицелий препятствует полимеризации фенольного соединения лакказой и направляет реакцию димеризации по пути образования продуктов, отличных от реакции без мицелия. Это существенно расширяет представления о метаболизме фенольных соединений грибами, однако механизм реакции требует дальнейшего изучения. Работы, выполненные в рамках проекта, вносят существенный вклад в понимание механизмов протекания окислительных реакций в почвах, в представления о молекулярной структуре и устойчивости гуминовых веществ как группы соединений, широко распространенных в почвах, осадках и природных водах. Доказана ключевая роль лакказы – окислительного фермента, наиболее распространенного в почвенных продуцентах, в синтезе и деструкции полифенольных ароматических компонентов почвенного гумуса. Впервые предложены модели взаимодействия фенольных субстратов и ГК с лакказой на основе анализа трехмерных структур фермента, накладывающие ограничения на размер реагирующих веществ. Клонированы гены лакказ лишайников, что не имеет аналогов в мировых исследованиях. Все запланированные по проекту работы выполнены. Дополнительно проведены исследования по изучению роли двухдоменных бактериальных лакказ в гумификации, существенно дополняющие представления о трансформации ГК при щелочных рН.