ИСТИНА

Цель работы состоит в выяснении молекулярного механизма электрогенного переноса ионов водорода и сопряжения его с переносом электронов в ходе кислород-редуктазной реакции, катализируемой цитохромоксидазой. Практическое назначение заключается в составлении полной картины электрогенных микрособытий в каталитическом цикле ферментов, относящихся к гем-медному суперсемейству терминальных оксидаз: цитохромоксидазы митохондрий, аа3 оксидазы из Rhodobacter sphaeroides, а также сaa3 и ba3 оксидазы из Thermus thermophilus. Это необходимо для понимания особенностей сопряжения редокс-реакций с протонным транспортом и генерацией мембранного потенциала цитохромоксидазами разных семейств внутри суперсемейства, способствует расширению представлений о работе наиболее важных с физиологической и медицинской точек зрения цитохромоксидаз, а также выяснению общих принципов проведения протонов и трансформации энергии в мембранных белках.

Методом разрешенной во времени многоволновой спектрофотометрии разрешены два переходных процесса обратного тока электронов из биядерного центра во входные редокс-центры в цитохромоксидазе caa3 из T.thermophilus в состоянии смешанной валентности: 1) первичный перенос электронов между гемами а и а3 в наносекундной временной шкале; 2) перенос электронов c ~30-40 мкс от гема а к двум редокс-центрам (CuA и цитохрому с), находящимся в быстром равновесии друг с другом. В отличие от цитохромоксидазы из митохондрий, перенос электронов из биядерного центра к гему а, вызванный диссоциацией CO от CuB, происходит в ~12 раз медленнее (~40 мкс вместо ~3 мкс) и не разрешается как отдельный переходный процесс. Для цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus, встроенной в протеолипосомы, показано, что обратный перенос электронов к паре СuA/цитохром с сопровождается генерацией мембранного потенциала с ~30-40 мкс. Амплитуда образующейся разности потенциалов зависит от начальной степени восстановленности входных редокс-центров (гем а, CuA, цитохром с), вследствие их антикооперативного взаимодействия с биядерным центром фермента, и достигает максимального значения при усредненной восстановленности молекул фермента ~3.6 электронами. Кинетика генерации мембранного потенциала, сопряженная c переходом OH ->EH в каталитическом цикле цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, характеризуется быстрой (~10-30 мкс) и медленной (~0.4-1 мс) компонентами. Быстрая фаза вызвана переносом электрона на низкоспиновый гем b от CuA, тогда как медленная фаза обусловлена электрогенным переносом протона, сопряженным с реокислением гема b биядерным центром. Мутант с заменой D372I в области над биядерным центром характеризуется сохранением как быстрой, так и медленной электрогенных фаз. Данный результат является указанием на то, что в переходе OH ->EH цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus не происходит высвобождения помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны, а медленная электрогенная фаза обусловлена переносом протона из внутренней водной фазы в каталитический центр фермент через протон-проводящую структуру, расположенную под биядерным центром.