ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Использование флуоресцентных методов, таких, как резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), становится важнейшим инструментом изучения динамики работы биологических макромолекул. Использование этих методов позволяет заполнить разрыв между изучением статической структуры макромолекулярных комплексов и изучением кинетических параметров работы этих комплексов, как ферментов. Изучение работы рибосомы с помощью методов флуоресценции ведется уже давно. Для этого детально разработаны методы введения флуоресцентных меток в лиганды рибосомы, значительно уступающие ей в размерах. Методы введения флуоресцентных меток в саму рибосому, напротив, практически не разработаны, несмотря на острую необходимость. Именно направленное введение флуоресцентных меток в рибосому, громадный рибонуклеопротеидный комплекс, позволит изучать в режиме реального времени движения структурных элементов рибосомы друг относительно друга и относительно лигандов рибосомы. В первую очередь планируется изучить конформационные изменения рибосомы, сопровождающие транслокацию – перемещение практически всех лигандов рибосомы. При транслокации происходит смещение мРНК на три нуклеотида и перемещение двух транспортных РНК между участками связывания. Кроме того, для осуществления транслокации рибосома взаимодействует с крупным белком – EF-G, который, в процессе транслокации, производит гидролиз GTP. Структура начального и конечного состояния транслокации достаточно хорошо изучена. В тоже время структурные перестройки, происходящие во время транслокации, во многом остаются загадкой. Для направленного введения флуоресцентных молекул в рибосому мы планируем использовать два подхода. Во-первых, использовать специфичные рРНК метилтрансферазы. В нашей лаборатории имеется полный набор штаммов, продуцирующих сайт-специфичные рРНК метилтрансферазы. Также имеется набор штаммов, лишенных соответствующих генов рРНК-метилтрансфераз на хромосоме. Рибосомы или рРНК, в зависимости от специфичности метилтрансферазы, из таких штаммов могут служить субстратами для метилтрансфераз в пробирке. Мы планируем проводить модификацию рибосом метилтрансферазами, используя вместо природного кофактора – S-аденозил-L-метионина его аналог, содержащий вместо метильной группы алифитический радикал, содержащий концевую тройную связь. После ферментативного введения такого радикала вместо метильной группы в рРНК, мы планируем провести модификацию рРНК флуоресцентными метками, содержащими азидогруппу с помощью реакции циклоприсоединения, катализируемой ионами Cu(I). Во-вторых, для направленного введения флуоресцентной метки в рибосому мы планируем использовать рибосомные белки, в последовательность которых мы будем вводить петлю, содержащую четыре остатка цистеина. Подобная пептидная петля специфически реагирует с реагентами FlAsH и ReAsH, содержащими флуоресцентные молекулы и мышьяк-содержащую связующую группу.
Получены плазмиды, в которых закодированы гибридные белки mCherry и S2, S4, L16 и L17. Происходит встраивание гибридного белка S2-mCherry в рибосому. Разработан метод, позволяющий проводить сравнение вновь синтезированных протеом с помощью двумерного гель электрофореза. Аналог метионина, гомопропаргилглицин, включается во вновь синтезируемые белки. Обработка HPG-содержащих белков азидопроизводными флюоресцентных красителей в присутствии меди (I) приводит к их селективному флюоресцентному мечению. Мы усовершенствовали эту систему для использования в дальнейшем двумерном гель-электрофорезе. Потребовалось синтезировать новые моносульфированные производные флюоресцентных красителей Cy3 и Cy5 для того, чтобы при внедрении флюорофоров в HPG-содержащий белок не изменялся его заряд. В ходе работы была разработана двойная репортёрная конструкция, основанная на генах двух флуоресцентных белков (RFP и CER), позволяющая проводить многофакторный анализ влияния различных элементов мРНК на эффективность трансляции. При помощи данной конструкции было впервые показано, что in vivo наибольшую относительную эффективность трансляции обеспечивает SD наибольшего размера (8 нуклеотидов), расположенная на максимально близком к стартовому кодону расстоянии, а для среднего расстояния от старта трансляции было продемонстрировано наличие оптимального значения длины SD, равное 6 нуклеотидам. Роль SD в трансляции второго гена в опероне также была исследована, и оказалось, что в случае перекрывания или близкого расположения стартового и стоп-кодонов SD не настолько необходима для эффективной трансляции, как в случаях большего расстояния между генами одной матрицы или моноцистронных матриц. Полученные результаты позволили лучше понять и количественно оценить эффекты, оказываемые различными элементами мРНК на трансляцию. Также разработан метод, позволяющий во множестве образцов РНК проверять наличие модифицированного m6A в заданном положении. Метод необхрдим для поиска генов, отвечающих за конкретный модифицированный нуклеотид или условий, при которых происходит модификация. Метод основан на измерении параметров плавления дуплексов изучаемой РНК с олигонуклеотидными зондами, несущими флюорофор и тушитель флюоресценции.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2011 г.-31 декабря 2013 г. | Изучение динамики работы рибосомы с помощью сайт-направленного введения флуоресцентных меток |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".