ИСТИНА

Проект направлен на изучение функциональной роли и механизмов модификации компонентов аппарата трансляции. Изменение функциональных свойств РНК с помощью ферментативной модификации изучено гораздо хуже, чем для ферментативной модификации белков и ДНК. В рамках проекта предстоит изучить функциональную роль модификации рРНК у бактерий. Будет проведен сравнительный протеомный анализ штаммов, лишенных каждого из модифицированных нуклеотидов. На основе протеомного анализа будут созданы проверяемые гипотезы о возможной функциональной роли того или иного модифицированного нуклеотида в экспрессии определенных групп генов. Для изучения роли модификации рРНК также будет использована создающаяся в лаборатории постоянно расширяющаяся коллекция репортерных плазмид, каждая из которых показывает эффективность экспрессии природных или модельных сигналов инициации трансляции или транскрипции. Второй задачей проекта будет изучение модификации (метилирования) мРНК эукариот. Для этого будут отработаны условия временной инактивации метилтрансферазы METTL3 и деметилазы FTO с помощью РНК интерференции с использованием модели клеточных линий. Для проверки влияния метилирования мРНК на биогенез, деградацию, локализацию и трансляцию мРНК, будет создана репортерная конструкция на основе гена флюоресцентного белка mCherry в составе ретровирусного вектора. К гену mCherry будет добавлен участок гена LDLR, содержащий участок метилирования. Будут определены детерминанты мРНК, необходимые для модификации и влияние модификации на все этапы функционирования мРНК.

Цель работы - понимание функциональной роли модифицированных нуклеотидов РНК, как рибосомной (рРНК), так и матричной (мРНК). Основной подход, используемый в работе, это инактивация генов, отвечающих за модификацию и анализ фенотипа полученных клеток. В 2012 году нами был завершен поиск генов, ответственных за модификацию рРНК E. coli. Для последнего модифицированного нуклеотида рРНК, m6A2030, был найден модифицирующий фермент - YhiR. Кроме того, была создана широкомасштабная система репортерных конструкций, позволяющих оценивать функционирование практически всех механизмов регуляции экспрессии генов E. coli. Была определена функциональная роль модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 16S рРНК. Отсутствие модификации этих нуклеотидов приводит к постоянной, независящей от концентрации триптофана, индукции экспрессии триптофанового оперона. Для системы метилирования мРНК эукариот подобраны условия нокдауна генов METTL3 и FTO, отвечающих за метилирование и деметилирование мРНК, соответственно.