Биодеградируемые полимер-липидные наноконъюгаты для инкапсулирования лекарственных веществ и визуализации их внутриклеточной доставкиНИР

Biodegradable polymer-lipid nanoconjugates for drugs encapsulation and imaging of their intracellular delivery

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 12 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. Биодеградируемые полимер-липидные наноконъюгаты для инкапсулирования лекарственных веществ и визуализации их внутриклеточной доставки
Результаты этапа: 1) Был получен протокол получения и описание физико-химических характеристик хитозановых наночастиц; 2)Был получен протокол получения электростатического комплекса анионных липосом с катионными хитозановыми наночастицами (наноконъюгата); 3) Были определены адсорбционная емкость хитозановых наночастиц по липосомам (состав наноконъюгата) и стабильность наноконъюгата в водно-солевых средах (минимальная концентрации соли, при которой начинается диссоциация наноконъюгатана исходные компоненты); 4) был создан протокол определения целостности липосом, связанных в наноконъюгат с хитозановыми наночастицами, описание условий получения наноконъюгатов с неразрушенными липосомами; 5) Была исследована кинетика биодеструкции наноконъюгата в присутствиии фермента липазы и протеолитического комплекса Морикраза; 6) Были определены цитотоксичность наноконъюгата и продуктов его биодеструкции.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Биодеградируемые полимер-липидные наноконъюгаты для инкапсулирования лекарственных веществ и визуализации их внутриклеточной доставки
Результаты этапа: В работе были использованы липосомы, сформированные из электронейтрального фосфатидилхолина (ФХ) и анионного дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ2-) с мольной долей анионных КЛ2- групп ν = 2[КЛ2-]/(2[КЛ2-]+[ФХ]) = 0.1. Для заполнения липосом противоопухолевым антибиотиком доксорубицином (Докс) использовали «рН-градиентные» липосомы с буфером рН 3,0 внутри и буфером рН 7,0 во внешнем объеме. Накопление лекарства внутри липосом приводит к протонированию молекул Докс, что блокирует его выход в окружающий раствор, и сопровождается тушением его флуоресценции. Липосомы, нагруженные противоопухолевым лекарством цисплатином, получали ультразвуковой обработкой липидной суспензии в водном растворе лекарства. Размер (гидродинамический диаметр) липосом практически не зависел от способа получения и составлял 40±10 нм. Электрофоретическая подвижность (ЭФП) полученных липосом буферном растворе с рН 7,0 равнялась -1,9±0,1 (мкм/с)/(В/см). Микрочастицы хитозана формировали из полимера со средневесовыми молекулярными массами (ММ) 30, 63 и 300 кДа и мольным содержанием первичных аминогрупп равным 0,85. Хитозан растворяли в воде, добавляли раствор сульфата натрия, перемешивали и диализовали против ацетатного буфера с рН 5,5. Полученные микрочастицы «ионно-сшитого» (через сульфатные мостики) хитозана демонстрировали агрегативную стабильность в 0,15 М растворе NaCl. ЭФП микрочастиц хитозана в буферном растворе с рН 5,5 составила +1,6 ±0,1(мкм/с)/(В/см). Средний диаметр микрочастиц хитозана при рН 5,5 составляет 280 нм. Затем с ростом рН размер микрочастиц уменьшается до минимального 230-235 нм при рН 6,5-7, после чего возвращается к размеру, который характерен для частиц в растворе с рН 5,5. Увеличение ММ хитозана с 30 до 63 кДа практически не сказывалось на размере микрочастиц; последующее повышение ММ до 300 кДа сопровождалось заметным (примерно на 100 нм) ростом их размера. Ожидается, что наноконъюгаты будут поглощаться клетками по механизму пассивного транспорта. Оптимальный размер частиц, проникающих в клетку по такому механизму, лежит в интервале 200-400 нм. Поэтому для формирования наноконъюгатов были взяты микрогели, полученные из линейного хитозана с ММ = 63 кДа. Размер микрочастиц в водном растворе с рН 7,0 составлял 240 нм; формирование монослоя адсорбированных анионных липосом диаметром 50 нм должно было увеличить размер микрочастиц до 240+100=350 нм. Наноконъюгаты получали путем электростатической адсорбции анионных ФХ/КЛ2- липосом, нагруженных Докс или цисплатином, на поверхности хитозановых микрочастиц. Адсорбцию проводили в буферном растворе с рН 5,5, где оба компонента несут противоположные по знаку заряды: микрочастицы положительный и липосомы отрицательный, и температуре 20 °С. За образованием наноконъюгата следили, регистрируя ЭФП частиц в системе «хитозановая микрочастица + липосома». Связывание липосом на поверхности хитозановых микрочастиц (формирование наноконъюгата) сопровождалось нейтрализацией поверхностного заряда микрочастиц и их перезарядкой при больших концентрациях липосом. Комплексообразование сопровождалось увеличением размера частиц в системе с максимумом в области полной нейтрализации заряда хитозановых микрочастиц. В дальнейшем липосомы с лекарственными препаратами адсорбировали на поверхности микрочастиц в растворе с рН 5,5 и затем меняли внешний раствор на буфер с рН 7,0. Свободные (не связанные с хитозановыми микрочастицами) липосомы сохраняли инкапсулированное лекарство (Докс) в течение суток после получения. На вторые сутки Докс появлялся в окружающем растворе, процесс выхода Докс завершался через трое суток. В отличие от этого, липосомы в составе наноконъюгатов на четвертые сутки теряли лишь 20-30% инкапсулированного лекарства. Таким образом, включение липосом с Докс в комплекс с хитозаном повышает стабильность всей конструкции при длительном хранении. Для оценки цитотоксичности наноконъюгатов с Докс и цисплатином использовали стандартный МТТ тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ и эстераз конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий-бромид жёлтого цвета в пурпурный формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Формазан образуется только в живых клетках, и его количество позволяет рассчитать процент выживших клеток от их общего числа после добавления какого-либо реагента. Использовали два типа клеток: чувствительные к Докс MCF-7 и устойчивые к Докс MCF-7/R. В качестве количественной меры цитотоксичности использовали значение концентрации добавленного вещества, при которой наблюдается гибель 50% клеток (LC50). Для оценки цитотоксичности наноконъюгатов были приготовлены положительно заряженный и отрицательно заряженный наноконъюгаты с липосомами, заполненными Докс. Их цитотоксичность сравнивали с цитотоксичностью свободного Докс и Докс, инкапсулированного в ФХ/КЛ2- липосомы. Цитотоксичность свободного Докс по отношению к чувствительным MCF-7 клеткам и устойчивым MCF-7/R клеткам составила LC50 = 1.6±0.05 мкМ и 210±50 мкМ, соответственно. Инкапсулирование Докс в липосомы значительно уменьшало его цитотоксичность: до LC50 = 5,4 ± 1,2 мкМ для чувствительных клеток и 300±60 мкМ для устойчивых. Эксперименты с наноконъюгатами, содержащими Докс, и чувствительными клетками MCF-7 показали уменьшение значения LC50, то есть увеличение цитотоксичности наноконъюгата по сравнению с Докс-содержащими липосомами. При этом токсичность Докс-содержащих липосом и обоих типов наноконъюгатов была ниже токсичности свободного лекарства. Принципиально иной результат дали эксперименты с устойчивыми клетками MCF-7/R. Если в экспериментах с отрицательно заряженными наноконъюгатами наблюдалось незначительное уменьшение LC50 до 275±70 мкМ, то положительно заряженные комплексы показали уменьшение LC50 до 75±15 мкМ. Последнее значение было ниже не только LC50 для Докс-содержащих липосом, но и LC50 для свободного лекарства. Это означает, что связывание Докс-содержащих липосом в комплекс с хитозановыми микрогелями усиливает токсичность лекарственного средства по отношению к устойчивым клеткам. Полученные результаты показывают, что положительно заряженные комплексы (наноконъюгаты) ионно-сшитого хитозана с анионными липосомами, нагруженными Докс, могут преодолевать множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. МТТ тест был использован и для определения токсичности наноконъюгатов, нагруженных цисплатином. Свободный цисплатин (контроль 1) оказался нетоксичным вплоть до концентрации 1,5 мкМ. Смесь цисплатина с хитозаном (контроль 2) и нагруженные лекарством липосомы в отсутствии хитозана (контроль 3) не проявляли цитотоксичности во всем интервале исследованных концентраций. В то же время инкубация клеток MCF-7/R с наноконъюгатами, нагруженными цисплатином, показала практически полную гибель клеток при 0,9 мкМ лекарства. Таким образом, мультилипосомальные конструкции из ионно-сшитого хитозана и адсорбированных на нем липосом можно использовать для загрузки лекарств и их доставки в раковые клетки. Биодеградацию наноконъюгатов, заполненных Докс и цисплатином, инициировали добавлением протеолитических ферментов липазы и лизоцима, а также протеолитического комплекса Морикраза (смеси ферментов различной специфичности). За процессом деструкции наноконъюгатов следили по изменению размера частиц в суспензии. В контрольном эксперименте при 20 °С в отсутствии ферментов размеры наноконъюгатов не менялись в течение 96 часов (4 дней). Добавление липазы к суспензиям наноконъюгатов разрушало слой адсорбированных липосом, но не затрагивало хитозанового ядра. Добавление лизоцима приводило к разрушению хитозанового ядра, но (с большой вероятностью) к сохранению липосом. Наконец, добавление Морикразы уменьшало размер частиц в системе до 10-15 нм, что указывало на практически полное разрушение липидов и хитозана. Таким образом, наноконъюгаты хитозан-липосомы могут быть разрушены до наноразмерных фрагментов и выведены из организма. Помимо этого, была исследована биодеструкция наноконъюгатов под действием Морикразы при 4 и 37 °С. При всех температурах добавление Морикразы инициировало постепенное уменьшение размера частиц в суспензии до 10-15 нм, при этом скорость биодеградации возрастала с увеличением температуры. Параллельно с разрушением наноконъюгатов контролировали высвобождение инкапсулированных в липосомах веществ – Докс и циплатина. Высвобождение лекарств из наноконъюгатов начиналось через несколько часов после добавления Морикразы: от 2-7 часов при 4 °C до 2 часов при 37 °C; размер частиц в системе за это время уменьшался незначтительно. На этой начальной стадии ферменты Морикразы атаковали лишь эфирные связи в молекулах липидов, а ядро конъюгата, сформированное хитозаном, оставалось нетронутым. Через 2-7 часов повреждения в липидном бислое инициировали вытекание инкапсулированного лекарства в окружающий раствор; для полного высвобождения лекарств требовалось от 14-20 часов при 4 °C до 4 часов при 37 °C. Вытекание лекарств развивалось на фоне прогрессивного уменьшения размера частиц. На завершающей стадии биодеградации подвергались хитозановые ядра наноконъюгатов. Для контроля внутриклеточной локализации Докс использовали устойчивые клетки MCF-7/R. На микрофотографиях, полученных после добавления к суспензии клеток свободного Докс и Докс-содержащих липосом, видны слабо прокрашенные клетки, при этом ни Докс, ни Докс-содержащие липосомы не прокрашивали ядра клеток. Этот результат хорошо согласуется с данными по множественной лекарственной устойчивости клеток MCF-7/R. Напротив, положительно заряженные наноконъюгаты способствовали накоплению Докс в ядрах клеток MCF-7/R, на что указывало интенсивное окрашивание ядер клеток в красный цвет. Этот результат говорит о возможном преодолении множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток мультилипосомальными наноконъюгатами. Оценка содержания доксорубицина в клетках с помощью конфокальной микроскопи показала, что доля проникшего в клетки свободного Докс составляет 1%, для липосомального Докс эта величина составила 0,8% и для Докс в составе наноконтейнеров 4,3%. В дополнение к этому были получены наноконъюгаты из анионных липосом, нагруженных Докс, и мицелл, сформированных из смеси полилактида с концевой аминогруппой и сополимера полилактид/полиэтиленоксид. Каждая мицелла адсорбировала около 30 интактных (неразрушенных) липосом. Полученные наноконъюгаты сохраняли устойчивость к ферментативному гидролизу в течение 2 недель после приготовления. Описан одностадийный синтез композитов из наночастиц маггемита (γ-Fe2O3) и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Растворение композитов в воде дает агрегативно устойчивые дисперсии, реагирующие на внешнее магнитное поле. Полученные композиты могут быть использованы для инкапсулирования и контролируемой доставки биологически активных веществ. дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ2-) с мольной долей анионных КЛ2- групп ν = 2[КЛ2-]/(2[КЛ2-]+[ФХ]) = 0.1. Для заполнения липосом противоопухолевым антибиотиком доксорубицином (Докс) использовали «рН-градиентные» липосомы с буфером рН 3,0 внутри и буфером рН 7,0 во внешнем объеме. Накопление лекарства внутри липосом приводит к протонированию молекул Докс, что блокирует его выход в окружающий раствор, и сопровождается тушением его флуоресценции. Липосомы, нагруженные противоопухолевым лекарством цисплатином, получали ультразвуковой обработкой липидной суспензии в водном растворе лекарства. Размер (гидродинамический диаметр) липосом практически не зависел от способа получения и составлял 40±10 нм. Электрофоретическая подвижность (ЭФП) полученных липосом буферном растворе с рН 7,0 равнялась -1,9±0,1 (мкм/с)/(В/см). Микрочастицы хитозана формировали из полимера со средневесовыми молекулярными массами (ММ) 30, 63 и 300 кДа и мольным содержанием первичных аминогрупп равным 0,85. Хитозан растворяли в воде, добавляли раствор сульфата натрия, перемешивали и диализовали против ацетатного буфера с рН 5,5. Полученные микрочастицы «ионно-сшитого» (через сульфатные мостики) хитозана демонстрировали агрегативную стабильность в 0,15 М растворе NaCl. ЭФП микрочастиц хитозана в буферном растворе с рН 5,5 составила +1,6 ±0,1(мкм/с)/(В/см). Средний диаметр микрочастиц хитозана при рН 5,5 составляет 280 нм. Затем с ростом рН размер микрочастиц уменьшается до минимального 230-235 нм при рН 6,5-7, после чего возвращается к размеру, который характерен для частиц в растворе с рН 5,5. Увеличение ММ хитозана с 30 до 63 кДа практически не сказывалось на размере микрочастиц; последующее повышение ММ до 300 кДа сопровождалось заметным (примерно на 100 нм) ростом их размера. Ожидается, что наноконъюгаты будут поглощаться клетками по механизму пассивного транспорта. Оптимальный размер частиц, проникающих в клетку по такому механизму, лежит в интервале 200-400 нм. Поэтому для формирования наноконъюгатов были взяты микрогели, полученные из линейного хитозана с ММ = 63 кДа. Размер микрочастиц в водном растворе с рН 7,0 составлял 240 нм; формирование монослоя адсорбированных анионных липосом диаметром 50 нм должно было увеличить размер микрочастиц до 240+100=350 нм. Наноконъюгаты получали путем электростатической адсорбции анионных ФХ/КЛ2- липосом, нагруженных Докс или цисплатином, на поверхности хитозановых микрочастиц. Адсорбцию проводили в буферном растворе с рН 5,5, где оба компонента несут противоположные по знаку заряды: микрочастицы положительный и липосомы отрицательный, и температуре 20 °С. За образованием наноконъюгата следили, регистрируя ЭФП частиц в системе «хитозановая микрочастица + липосома». Связывание липосом на поверхности хитозановых микрочастиц (формирование наноконъюгата) сопровождалось нейтрализацией поверхностного заряда микрочастиц и их перезарядкой при больших концентрациях липосом. Комплексообразование сопровождалось увеличением размера частиц в системе с максимумом в области полной нейтрализации заряда хитозановых микрочастиц. В дальнейшем липосомы с лекарственными препаратами адсорбировали на поверхности микрочастиц в растворе с рН 5,5 и затем меняли внешний раствор на буфер с рН 7,0. Свободные (не связанные с хитозановыми микрочастицами) липосомы сохраняли инкапсулированное лекарство (Докс) в течение суток после получения. На вторые сутки Докс появлялся в окружающем растворе, процесс выхода Докс завершался через трое суток. В отличие от этого, липосомы в составе наноконъюгатов на четвертые сутки теряли лишь 20-30% инкапсулированного лекарства. Таким образом, включение липосом с Докс в комплекс с хитозаном повышает стабильность всей конструкции при длительном хранении. Для оценки цитотоксичности наноконъюгатов с Докс и цисплатином использовали стандартный МТТ тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ и эстераз конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий-бромид жёлтого цвета в пурпурный формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Формазан образуется только в живых клетках, и его количество позволяет рассчитать процент выживших клеток от их общего числа после добавления какого-либо реагента. Использовали два типа клеток: чувствительные к Докс MCF-7 и устойчивые к Докс MCF-7/R. В качестве количественной меры цитотоксичности использовали значение концентрации добавленного вещества, при которой наблюдается гибель 50% клеток (LC50). Для оценки цитотоксичности наноконъюгатов были приготовлены положительно заряженный и отрицательно заряженный наноконъюгаты с липосомами, заполненными Докс. Их цитотоксичность сравнивали с цитотоксичностью свободного Докс и Докс, инкапсулированного в ФХ/КЛ2- липосомы. Цитотоксичность свободного Докс по отношению к чувствительным MCF-7 клеткам и устойчивым MCF-7/R клеткам составила LC50 = 1.6±0.05 мкМ и 210±50 мкМ, соответственно. Инкапсулирование Докс в липосомы значительно уменьшало его цитотоксичность: до LC50 = 5,4 ± 1,2 мкМ для чувствительных клеток и 300±60 мкМ для устойчивых. Эксперименты с наноконъюгатами, содержащими Докс, и чувствительными клетками MCF-7 показали уменьшение значения LC50, то есть увеличение цитотоксичности наноконъюгата по сравнению с Докс-содержащими липосомами. При этом токсичность Докс-содержащих липосом и обоих типов наноконъюгатов была ниже токсичности свободного лекарства. Принципиально иной результат дали эксперименты с устойчивыми клетками MCF-7/R. Если в экспериментах с отрицательно заряженными наноконъюгатами наблюдалось незначительное уменьшение LC50 до 275±70 мкМ, то положительно заряженные комплексы показали уменьшение LC50 до 75±15 мкМ. Последнее значение было ниже не только LC50 для Докс-содержащих липосом, но и LC50 для свободного лекарства. Это означает, что связывание Докс-содержащих липосом в комплекс с хитозановыми микрогелями усиливает токсичность лекарственного средства по отношению к устойчивым клеткам. Полученные результаты показывают, что положительно заряженные комплексы (наноконъюгаты) ионно-сшитого хитозана с анионными липосомами, нагруженными Докс, могут преодолевать множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. МТТ тест был использован и для определения токсичности наноконъюгатов, нагруженных цисплатином. Свободный цисплатин (контроль 1) оказался нетоксичным вплоть до концентрации 1,5 мкМ. Смесь цисплатина с хитозаном (контроль 2) и нагруженные лекарством липосомы в отсутствии хитозана (контроль 3) не проявляли цитотоксичности во всем интервале исследованных концентраций. В то же время инкубация клеток MCF-7/R с наноконъюгатами, нагруженными цисплатином, показала практически полную гибель клеток при 0,9 мкМ лекарства. Таким образом, мультилипосомальные конструкции из ионно-сшитого хитозана и адсорбированных на нем липосом можно использовать для загрузки лекарств и их доставки в раковые клетки. Биодеградацию наноконъюгатов, заполненных Докс и цисплатином, инициировали добавлением протеолитических ферментов липазы и лизоцима, а также протеолитического комплекса Морикраза (смеси ферментов различной специфичности). За процессом деструкции наноконъюгатов следили по изменению размера частиц в суспензии. В контрольном эксперименте при 20 °С в отсутствии ферментов размеры наноконъюгатов не менялись в течение 96 часов (4 дней). Добавление липазы к суспензиям наноконъюгатов разрушало слой адсорбированных липосом, но не затрагивало хитозанового ядра. Добавление лизоцима приводило к разрушению хитозанового ядра, но (с большой вероятностью) к сохранению липосом. Наконец, добавление Морикразы уменьшало размер частиц в системе до 10-15 нм, что указывало на практически полное разрушение липидов и хитозана. Таким образом, наноконъюгаты хитозан-липосомы могут быть разрушены до наноразмерных фрагментов и выведены из организма. Помимо этого, была исследована биодеструкция наноконъюгатов под действием Морикразы при 4 и 37 °С. При всех температурах добавление Морикразы инициировало постепенное уменьшение размера частиц в суспензии до 10-15 нм, при этом скорость биодеградации возрастала с увеличением температуры. Параллельно с разрушением наноконъюгатов контролировали высвобождение инкапсулированных в липосомах веществ – Докс и циплатина. Высвобождение лекарств из наноконъюгатов начиналось через несколько часов после добавления Морикразы: от 2-7 часов при 4 °C до 2 часов при 37 °C; размер частиц в системе за это время уменьшался незначтительно. На этой начальной стадии ферменты Морикразы атаковали лишь эфирные связи в молекулах липидов, а ядро конъюгата, сформированное хитозаном, оставалось нетронутым. Через 2-7 часов повреждения в липидном бислое инициировали вытекание инкапсулированного лекарства в окружающий раствор; для полного высвобождения лекарств требовалось от 14-20 часов при 4 °C до 4 часов при 37 °C. Вытекание лекарств развивалось на фоне прогрессивного уменьшения размера частиц. На завершающей стадии биодеградации подвергались хитозановые ядра наноконъюгатов. Для контроля внутриклеточной локализации Докс использовали устойчивые клетки MCF-7/R. На микрофотографиях, полученных после добавления к суспензии клеток свободного Докс и Докс-содержащих липосом, видны слабо прокрашенные клетки, при этом ни Докс, ни Докс-содержащие липосомы не прокрашивали ядра клеток. Этот результат хорошо согласуется с данными по множественной лекарственной устойчивости клеток MCF-7/R. Напротив, положительно заряженные наноконъюгаты способствовали накоплению Докс в ядрах клеток MCF-7/R, на что указывало интенсивное окрашивание ядер клеток в красный цвет. Этот результат говорит о возможном преодолении множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток мультилипосомальными наноконъюгатами. Оценка содержания доксорубицина в клетках с помощью конфокальной микроскопи показала, что доля проникшего в клетки свободного Докс составляет 1%, для липосомального Докс эта величина составила 0,8% и для Докс в составе наноконтейнеров 4,3%. В дополнение к этому были получены наноконъюгаты из анионных липосом, нагруженных Докс, и мицелл, сформированных из смеси полилактида с концевой аминогруппой и сополимера полилактид/полиэтиленоксид. Каждая мицелла адсорбировала около 30 интактных (неразрушенных) липосом. Полученные наноконъюгаты сохраняли устойчивость к ферментативному гидролизу в течение 2 недель после приготовления. Описан одностадийный синтез композитов из наночастиц маггемита (γ-Fe2O3) и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Растворение композитов в воде дает агрегативно устойчивые дисперсии, реагирующие на внешнее магнитное поле. Полученные композиты могут быть использованы для инкапсулирования и контролируемой доставки биологически активных веществ.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".