ИСТИНА

Сборка субчастиц рибосомы представляет собой сложный многоступенчатый процесс, исследование которого необходимо для понимания процесса функционирования рибосомы в целом. На сегодняшний день основные исследования процесса сборки рибосомы ведутся in vitro, что связано с отсутствием удобных подходов для мониторинга процесса in vivo. Мы планируем изучение динамики сборки субчастиц рибосомы in vivo. Основным методом изучения динамики работы макромолекул является резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), который позволяет исследовать в режиме реального времени движения структурных элементов рибосомы друг относительно друга. Для метода FRET в нашей лаборатории имеется полный набор генов бактерии Escherichia coli, объединенных с геном флуоресцентного белка GFP. Мы планируем создать конструкции гибридных белков, состоящих из рибосомных белков и другого флуоресцентного белка, например mCherry. Совместная экспрессия пар гибридных белков в клетках позволит нам наблюдать сборку рибосомы in vivo, так как при сближении белков будет наблюдаться FRET. Таким образом, мы планируем изучать процесс сборки рибосомы в зависимости от условий: солевого, кислотного, осмотического стрессов; присутствия в среде антибиотиков.

Для изучения конформационных изменений, происходящих в процессе работы рибосомы, необходима пара флюорофоров, образующих FRET пару. Таким образом можно будет наблюдать изменение FRET при изменении условий эксперимента. При сближении флюорофоров, спектр испускания одного будет перекрываться со спектром поглощения другого, за счет этого происходит перенос энергии. В нашей лаборатории имеется коллекция плазмид, т.н. ASKA+ коллекция, в которых закодированы гены кишечной палочки в виде гибридных белков с GFP. Плазмиды ASKA+ коллекции созданы на основе pCA24, несущей ген устойчивости к хлорамферниколу. Экспрессия генов гибридных белков находится под контролем IPTG-индуцируемого T5lac промотора. Мы проанализировали флюоресцентных белков, гены которых имелись в лаборатории, чтобы подобрать FRET пару для GFP, был выбран ген mCherry. На основании данных об экспрессии белков ASKA+ коллекции генов E.coli для работы были отобраны 7 белков в составе малой субчастицы рибосомы ( S1, S2, S4, S6, S8, S15, S19) и 4 белка (L6, L9, L16, L17) в составе большой субчастицы. После экспериментальной проверки уровня экспресии белков и компьютерного моделирования расположения белков в составе рибосомы были отобраны 2 белка малой субчастицы (S2, S4) и 2 белка большой субчастицы (L16, L17) рибосомы для дальнейшего клонирования с целью получения гибридного белка. В качестве плазмиды для суперэкспрессии была выбрана pCDF-Duet, несущая ген устойчивости к спектиномицину. Для создания штамма с полной совместимостью экспрессии с ASKA+ коллекцией необходимо поменять промотор в pCDF-Duet: был переклонирован тетрациклиновый промотор из плазмиды pAsk-IBA4. Рибосомный белок S2 вставляли по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI, S4 и L17 по BamHI и HindIII, L16 по HindIII и EcoRI. Флуоресцентный белок mCherry добавляли в плазмиду по сайту рестрикции SacI таким образом, чтобы между последним кодоном рибосомного белка и началом mCherry был линкер из 7 аминокислот. Полученные конструкции подтверждены секвенированием. Полученные гибридные гены с mCherry хорошо экспрессируются и клетки окрашены в вишневый цвет.