ИСТИНА

Конкретной фундаментальной задачей предлагаемого проекта являлоется изучение особенностей взаимодействия между ферментами и ионогенными блок-сополимерами, происходящего на поверхности, на которой методом последовательного нанесения формируются наноструктурированные фермент-полимерные пленки, а также систематическое исследование их строения и свойств (в том числе, и устойчивости) в зависимости от типа диблок-сополимера и фермента, а также условий, при которых происходит взаимодействие и/или адсорбция. Систематическое исследование свойств конкретных полимерных рецептур и условий включения в них целевых ферментов и сделанные на его основе выводы и рекомендации позволят эффективно модифицировать различные поверхности ферментами для создания нового поколения высокоэффективных сенсорных систем, а при необходимости без смены технологии позволят перейти к модификации поверхностей иными биообъектами, что является в настоящее время чрезвычайно востребованным, в частности, для получения высокоактивных сенсорных материалов.

В ходе выполнения проекта исследованы (1) особенности взаимодействия ионогенных амфифильных (мицеллообразующих) диблок-сополимеров и линейных гомополиэлектролитов с поверхностью графита и (2) особенности последующей адсорбции ферментов (холиноксидазы и тирозиназы) на поверхности графита, предварительно модифицированной полимерами. Показана возможность формирования на поверхности графита наноразмерных структурированных полимер-ферментных пленок, систематически исследованы их строение и свойства (в том числе, и устойчивость) в зависимости от типа диблок-сополимера и фермента, а также условий, при которых происходит взаимодействие и/или адсорбция. Методами динамического светорассеяния (DLS), анализа траекторий наночастиц (NTA) и криогенной просвечивающей электронной микроскопии (cryo-TEM) исследована самосборка амфифильных диблок-сополимеров в водных средах. Методом атомно-силовой микроскопии (АFМ) исследованы свойства пленок, образующихся при адсорбции мицелл диблок-сополимеров на поверхности высокоориентированного пиролитического графита, и проведено их сравнение со свойствами пленок соответствующих линейных гомополиэлектролитов. Показано, что тип гидрофобного блока (в частности, его температура стеклования Tg), а также внесение изменений в структуру молекулы диблок-сополимера (кватернизация) могут приводить к изменению его взаимодействия с поверхностью графита и давать совершенно различные по своей морфологии структуры несмотря на то, что в растворе данные полимерные объекты формируют одинаковые по строению надмолекулярные структуры мицеллярного типа, в которых ядро образовано гидрофобными блоками, а оболочка состоит из ионогенных блоков, экспонированных в водный раствор. Последующая адсорбция ферментов происходит только в местах локализации макромолекул диблок-сополимера, подтверждая тем самым существование взаимодействия между ними и ферментами, которое реализуется при нанесении компонентов методом послойной адсорбции. Методом измерения контактных углов охарактеризованы гидрофильно-гидрофобные свойства полимерных и полимер-ферментных пленок, сформированных в различных условиях. Для выяснения роли зарядов при взаимодействии мицелл диблок-сополимеров с поверхностью графита и при последующем электростатическом взаимодействии с ферментами, методами потенциометрического титрования и измерения электрофоретической подвижности было исследовано влияние степени заряженности диблок-сополимеров и ферментов от рН. Параллельно с этим методами AFM и микрогравиметрии с мониторингом диссипации (QCM-D) была изучена адсорбция компонентов пленки в зависимости от рН растворов диблок-сополимера и фермента. Помимо этого проанализирована специфическая ферментативная активность полимер-ферментных пленок на планарных графитовых сенсорных поверхностях. Обнаружено значительное увеличение массы и толщины слоя диблок-сополимеров, адсорбирующихся на поверхность гидрофобного графита в области щелочных рН адсорбции диблок-сополимеров, то есть в условиях, когда степень заряженности ионогенного блока минимальна. Количество фермента, способного связываться со слоем диблок-сополимера, зависит как от количества диблок-сополимера, адсорбированного на предыдущей стадии, так и от степени его заряженности (определяемой рН при котором проводят адсорбцию фермента). Полученный результат доказывает важность правильного подбора условий адсорбции каждого из компонентов, с учетом степени их заряженности и гидрофильно-гидрофобных свойств поверхности. Учет полученных факторов позволяет достичь 3-х кратного увеличения активности и стабильности биосенсорных покрытий для анализа фенола (с тирозиназой) и 2-х кратного улучшения активности и стабильности биосенсорных покрытий для анализа холина (с холиноксидазой) по сравнению с аналогичными полимер-ферментными поверхностями, опубликованными ранее. Прошивка получающихся в результате полимер-ферментных биосенсорных покрытий при помощи глутарового альдегида (в концентрации 0,2-1%) в качестве сшивающего реагента позволила дополнительно значительно увеличить операционную стабильность биосенсорных покрытий, что сделало возможным их практическое применение для анализа активности биохимически и токсикологически важных ферментов в цельной крови человека и экспериментальных животных. Полученные результаты представляют значительный интерес для выявления основных закономерностей формирования наноразмерных сенсорных покрытий с участием макромолекул ионогенных амфифильных диблок-сополимеров, способных к образованию надмолекулярных структур мицеллярного типа, и демонстрируют перспективность использования мицеллообразующих полимеров для создания сенсорных полимер-ферментных покрытий с улучшенной ферментативной активностью и стабильностью.