ИСТИНА

Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ), рассматриваемые в течение многих лет как строгие анаэробы, способны существовать в ряде биотопов, подвергающихся воздействию кислорода. Поскольку СРБ являются анаэробными микроорганизмами, кислород и, в особенности, продукты его неполного восстановления токсичны для их клеток, поэтому многие СРБ выработали разнообразные стратегии и механизмы антиокислительной защиты, включающие, в том числе, и уникальные ферменты. Изучение новых изолятов СРБ из аэробных местообитаний представляет собой ценный источник информации для открытия и исследования новых систем антиокислительной защиты. С этой целью сотрудниками Лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова летом 2010 г. были отобраны пробы из поверхностной аэробной водной толщи и зоны хемоклина (граница между аэробными и анаэробными водами) Черного моря, и получены активные накопительные культуры СРБ, устойчивых к кислороду. Основной целью данного проекта является изучение на молекулярном, биохимическом и клеточном уровнях различных систем антиокислительной защиты у СРБ, выделенных из аэробной водной толщи Черного моря, в тесном сотрудничестве между вышеупомянутыми российскими партнерами и французской Лабораторией изучения взаимодействий и модуляции ответов (Unit Interactions et Modulateurs de Reponses UPR3243, IFR88, CNRS), которая обладает большим опытом в исследовании всех аспектов протекания и регуляции окислительных стрессов в клетках СРБ.

Результаты за 2012 г. С помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза продуктов амплификации гена dsrB (кодирующего диссимиляционную сульфитредуктазу) и последующего секвенирования реамплифицированных нуклеотидных последовательностей нами был продемонстрирован различный филогенетический состав сообществ сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) на нескольких горизонтах поверхностной водной толщи Черного моря. Из подповерхностного окисленного слоя с глубины 30 м нами была выделена чистая культура психрофильной грамотрицательной неспорообразующей СРБ, отнесенной по результатам секвенирования гена 16S рРНК к роду Desulfofrigus (99% гомологии с Desulfofrigus fragile), с которой и проводили дальнейшую работу по изучению механизмов антиокислительной защиты. С использованием впервые сконструированных вырожденных праймеров на основные гены антиокислительной защиты сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) был проведен ПЦР-анализ наличия этих генов в геноме выделенной СРБ Desulfofrigus sp. Определяли наличие следующих генов антиокислительной защиты - кодирующих супероксиддисмутазу, десульфоферродоксин, рубреритрин, рубредоксин-кислород оксидоредуктазу, субъединицу I цитохром bd убихинолоксидазы, субъединицу I цитохром с оксидазы, бактериоферритин, алкилгидропероксидредуктазу, гибридный кластерный белок HCP1. Было показано, что в геноме исследуемого микроорганизма присутствуют гены, кодирующие супероксиддисмутазу (sod), десульфоферродоксин (dfx), рубреритрин (rbr), рубредоксин-кислород оксидоредуктазу (roo) и гибридный кластерный белок HCP1 (hcp). Гены dfx и hcp были клонированы с использованием плазмиды pGEM-T Easy и секвенированы (для секвенирования использовали по 4 соответствующих клона). Проведены эксперименты по определению скорости восстановления кислорода клетками выделенного нами в чистую культуру Desulfofrigus sp. с помощью полярографа и кислородного электрода Кларка с использованием различных субстратов (водород, лактат, сукцинат, НАДН, децилубихинол), а также ингибиторов (KCN, CO, 2-n-гептил-4-гидроксихинолин-N-оксид). Показано, что НАДН и лактат значительно усиливают восстановление кислорода клетками Desulfofrigus sp. Измерены спектры (в условиях восстановления дитионитом относительно окисления феррицианидом и относительно нативного образца, длины волн от 400 до 750 нм) клеток Desulfofrigus sp. для обнаружения и расчета концентраций цитохромов с, b и bd в клетках. Концентрация цитохрома с в целых клетках составила 0,44 нмоль/мг белка, также показано наличие цитохрома b. Проведены эксперименты по определению влияния различных концентраций кислорода на процесс сульфатредукции (измерение скорости сульфатредукции осуществляли радиоизотопным методом с использованием 35S-SO4, количество образуемого сероводорода оценивали также колориметрическим методом) и на рост (оценивали путем подсчета ДАФИ-окрашенных клеток под эпифлуоресцентным микроскопом) выделенной культуры Desulfofrigus sp. в жидкой питательной среде оптимизированного состава. Показано, что исследуемая культура является достаточно аэротолерантной, поскольку сохраняет высокую физиологическую активность при 1 мМ О2 в питательной среде, а полная остановка роста и прекращение сульфатредукции происходят только при концентрации кислорода, равной 5 мМ. Полученные результаты показали наличие в клетках выделенной нами из аэробных вод Черного моря культуры сульфатредуцирующей бактерии Desulfofrigus sp. сложных многокомпонентных систем ответа на окислительные стрессы, изучение функционирования и регуляции которых будет продолжено в ходе выполнения проекта в 2013-2014 гг.