![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Основной целью проекта является проведение комплекса сравнительных исследований, направленных на выявление изменений в состоянии ЭТЦ митохондрий, переключения между окислительным фосфорилированием и гликолизом, генерации АФК, изучении липидного состава цитоплазмы астроцитов и нейронов соматосенсорной коры мышей при обратимой и необратимой гипоксии различного генезиса, а также при функциональных нагрузках, приводящих к физиологической гипоксии у бодрствующих мышей. Данная задача является комплексной, так как требует применения новых методических подходов, позволяющих провести селективное и высокочувствительное исследование влияния гипоксии на разные комплексы в дыхательной цепи митохондрий, оценить возможные участки накопления электронов и сайты генерации О2-, осуществить детекцию образующихся АФК, изучить изменение активностей окислительного фосфорилирования и гликолиза, провести исследование динамики концентрации ионов Са2+ в цитоплазме клеток и матриксе митохондрий, влияющих на активность ЭТЦ, и сопоставить наблюдаемые изменения с локальным кровотоком и степенью оксигенации крови. Исследования будут проводиться in vivo в головном мозге анестезированных и бодрствующих животных. Данные исследования будут осуществляться комплексно, с использованием уникальных научных установок: конфокальных КР-микроспектрометров InVia Qontor (Renishaw, UK) и NTEGRA Spectrа (NTMDT, Россия) и мультифотонного флуоресцентного микроскопа (Femtonics FemtoSmart Dual, Венгрия), позволяющих работать с широким спектром объектов, от изолированных молекул до популяционной активности клеток мозга бодрствующих животных. Предлагаемая комбинация методов и подходов позволит получать информацию о редокс-состоянии комплексов ЭТЦ митохондрий в идентифицированных астроцитах и нейронах, конформации белков и липидном составе цитоплазмы клеток, динамике изменения концентраций АФК и ионов Са2+ в цитоплазме и митохондриях клеток, а также о степени оксигенации гемоглобина кровеносных сосудов мозга мышей. Благодаря этому будет выполнено детальное исследование энергетического состояния митохондрий и ЭТЦ-зависимой генерации АФК в астроцитах и нейронах и установлена роль метаболических изменений в астроцитах в процессах регуляции и нарушения нейроглиоваскулярных взаимодействий в условиях гипоксии, реоксигенации и функциональной нагрузки.
This project is devoted to the study of the mechanisms of regulation and the development of disorders of neurogliovascular interactions in the somatosensory cortex of the mouse brain in vivo under conditions of lhypoxia. The project is aimed at a comprehensive study of the role of astrocytes in the regulation of local blood flow and of the relationship between the metabolic and redox state of the state of astrocytes and neurons during hypoxia and subsequent reoxygenation. Particular attention will be paid to the study of the redox state of astrocyte mitochondria and the formation of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) associated with it, the relationship between the content of Ca2+ ions in the mitochondrial matrix and the cytoplasm of astrocytes with the state of the respiratory chain and switching between oxidative phosphorylation and glycolysis, as well as the correlation with these parameters of local blood oxygenation, vessel diameter, and the redox state of neurons in the somatosensory cortex of mice in vivo. It is well known that mitochondria play a fundamental role in the energy supply to the main types of brain cells - neurons and astrocytes, which proper functioning is greatly depend upon the precise adjustment of the amount of synthesized ATP and the rate of electron transport in the electron transport chain (ETC) of mitochondria to the needs of cellular activity and the O2 supply from blood vessels. A reduction of О2 concentration in tissue and subsequently in mitochondria leads to the accumulation of electrons in the mitochondrial ETC. This in turn leads to the formation of superoxide anion radicals, which transforms into Н2О2 and other forms of ROS initiating oxidative stress, which can lead to the cell death in the posthypoxic period after the restoration of the О2 supply in the tissue. Additionally the disturbed regulatory interactions between brain cells and blood vessels can be an additional source of the electrons accumulation in the ETC and the formation of ROS in mitochondria, due to the limited supply of O2 into the brain tissue from the blood vessels leading to insufficient synthesis of ATP and disturbed cell functions, causing various pathologies. Thus, when studying the effects of hypoxia, the simultaneous registration of local blood oxygenation and the tissue supply of O2, as well as the redox state of the mitochondrial ETC, is of particular importance. Currently, there are no available approaches that allow simultaneous and non-invasive assessment of the local blood oxygenation in the vessels, the energy state of mitochondria, and the protein-lipid composition of the cytoplasm of the brain cells. In this project, we will employ a novel methodological approach based on Raman microspectroscopy, which allows for selective and highly sensitive analysis of the hypoxia effects on various electron carriers in the mitochondrial respiratory chain, to evaluate possible sites of electron accumulation and ROS generation and study the lipid composition of the cytoplasm in neurons and astrocytes to detect lipid peroxidation and compare the observed changes with local blood flow and the degree of blood oxygenation. For the first time, this study will be performed in vivo on the somatosensory cortex of the anesthetized mice under hypoxia condition and in awake mice under functional load. The results obtained during this project will help to establish in which type of the brain cells - astrocytes or neurons - the greatest changes in the redox state of the mitochondrial ETC occur during and after systemic hypoxia and acute local hypoxia, and which cell type is the main source of ROS generation in the brain during the posthypoxic period. The effect of acute local hypoxia on the redox state of mitochondrial ETC, ROS generation and Ca2 + dynamics in both astrocytes and neurons will be compared with those occurring in these cells during the functional load. The resulting data on the effects of systemic and acute local hypoxia on astrocytes and neurons are of fundamental and applied value, since they model the pathological processes occurring in the brain during a systemic decrease in blood oxygenation observed during the coronavirus infection or brain stroke. The results of this project will significantly expand the range of methodological approaches to study mitochondria and monitor local blood oxygenation in the brain tissues, help to reveal the disturbed function of mitochondria under the hypoxic condition, and allow us to formulate possible medical recommendations that can reduce cell loss in stroke.
Ожидаемые результаты с разбивкой по годам 2023 год 1. Будут получены данные о степени заполнения ЭТЦ электронами в астроцитах и нейронах соматосенсорной коры анестезированных мышей при нормоксии, гипоксии и последующей реоксигенации in vivo. Будет выполнено сопоставление влияния кратковременной (1-2 мин) и долговременной (15-30 мин) гипоксий и реоксигенации на редокс-состояние комплексов ЭТЦ митохондрий указанных типов клеток. 2. Будут получены данные о степени оксигенации крови в сосудах и диаметре сосудов соматосенсорной коры анестезированных мышей в условиях: 1) нормоксии; 2) системной гипоксии: кратковременной (1-2 мин) и долговременной (15-30 мин); 3) при последующей реоксигенации и сопоставлены временные характеристики указанных свойств сосудов с характерными временами изменений редокс-состояния астроцитов и нейронов. 3. Получены данные об образовании Н2О2 или ее отсутствии в митохондриях астроцитов и нейронов соматосенсорной коры мышей при нормоксии, кратковременной гипоксии и реоксигенации in vivo и установлена взаимосвязь между количеством образующейся перекиси водорода и степенью заполнения электронами ЭТЦ в астроцитах и нейронах. Получены данные о липидном составе цитоплазмы нейронов и астроцитов анестезированных мышей при нормоксии, гипоксии и реоксигенации и сделаны выводы о наличии или отсутствии повреждения клеток по КР-сигналу окисленных липидов и продуктов деградации ДНК. 4. Получены первые в мире экспериментальные данные о генерации Н2О2 в митохондриях и редокс-состоянии ЭТЦ астроцитов в соматосенсорной коре бодрствующих мышей при беге - функциональной нагрузке, сопровождающейся физиологической гипоксией. 5. Будут получены данные о редокс-состоянии митохондрий астроцитов и образовании в них Н2О2 у бодрствующих мышей при острой локальной гипоксии, вызванной фототромбозом сосудов. 6. Получены данные о повреждении или гибели астроцитов по КР-сигналу продуктов окисления липидов и продуктов деградации ДНК через разные промежутки времени после индукции фотоповреждения сосуда. 7. Подготовка и публикация статей по полученным результатам. 2024 год 1. Получены КР-карты участков соматосенсорной коры анестезированных мышей, показывающие локализацию митохондрий и редокс-состояние их ЭТЦ в идентифицированных астроцитах и нейронах, степень оксигенации крови в артериолах и венулах в стационарных состояниях: при нормоксии, гипоксии и после реоксигенации. Установлены корреляции между редокс-состоянием митохондрий и их локализацией в телах астроцитов и концевых ножках астроцитов, степенью оксигенации крови в венулах и диаметром артериол и венул. 2. Получены данные о влиянии кратковременной гипоксии и реоксигенации на подвижность митохондрий в отростках астроцитов, в том числе, их концевых ножках, в соматосенсорной коре анестезированных мышей. 3. Получены данные об образовании Н2О2 в митохондриях нейронов и астроцитов в соматосенсорной коре мышей in vivo при нормоксии, долговременной гипоксии и последующей реоксигенации и сопоставлены обнаруженные изменения в содержании Н2О2 со степенью заполнения ЭТЦ электронами в митохондриях астроцитов и нейронов. Получены данные о липидном составе цитоплазмы астроцитов и нейронов для выявления продуктов перекисного окисления липидов вследствие возможного развития окислительного стресса при реоксигенации мозга. 4. Получены данные и сопоставлена генерация АФК (Н2О2) с изменением редокс-состояния цитохромов ЭТЦ митохондрий нейронов соматосенсорной коры бодрствующих мышей при беге - нормальной функциональной нагрузке, сопровождающейся гипоксией. 5. Получены данные об образовании Н2О2 в матриксе митохондрий, изменении редокс-состояния цитохромов ЭТЦ митохондрий нейронов соматосенсорной коры мозга бодрствующих мышей в модели острой локальной гипоксии, индуцированной фотоповреждением сосудов после введения в сосуды фоточувствительного красителя бенгальского розового. Проведена оценка повреждения и гибели нейронов в первые 30-60 мин, через 12 и 24 ч после индукции фотоповреждения сосудов по появлению в цитоплазме клеток продуктов перекисного окисления липидов и продуктов деградации ДНК. 6. Подготовлены и опубликованы статьи по полученным результатам, полученные результаты представлены на российских и международных конференциях. 2025 год 1. Получены данные о влиянии нитрита натрия на редокс-состояние цитохромов ЭТЦ митохондрий астроцитов и нейронов, степень оксигенации крови и диаметра сосудов в соматосенсорной коре мышей при нормоксии, системной кратковременной и долговременной гипоксии с последующей реоксигенацией (предварительное внутривенное введение нитрита натрия (за 10-15 мин до гипоксии)). Сделаны выводы о том, может ли нитрит натрия служить в качестве неспецифического акцептора электронов в ЭТЦ митохондрий астроцитов, давая оксид азота, выходящий в кровеносное русло и приводящий к расширению сосудов. 2. Установлено изменение соотношения связанного и свободного FAD, как показателя соотношения активностей окислительного фосфорилирования и гликолиза в астроцитах соматосенсорной коры мышей при кратковременной и долговременной гипоксии с последующей реоксигенацией. Полученные результаты сопоставлены с данными об изменении степени загруженности ЭТЦ электронами и образованием Н2О2 в астроцитах. 3. Установлено, каким образом и с какими временными характеристиками изменяется концентрация ионов Са2+ в матриксе митохондрий и цитоплазме нейронов и астроцитов соматосенсорной коры мозга бодрствующих мышей в модели острой локальной гипоксии, индуцированной фотоповреждением сосудов. 4. Получены данные о генерации Н2О2 в митохондриях и изменении редокс-состояния цитохромов ЭТЦ нейронов и астроцитов в ответ на гипоксию с последующей реоксигенацией на переживающих срезах мозга мышей. 5. Получены данные об изменениях редокс-состояния комплексов ЭТЦ митохондрий в астроцитах и нейронах в переживающих срезах мозга мышей при гипоксии различной длительности и реоксигенации. 6. Полученные результаты опубликованы в ведущих российских и зарубежных журналах и представлены на конференциях. 2026 год 1. Получены данные об образовании Н2О2 в астроцитах и нейронах в соматосенсорной коре мышей при нормоксии, системной кратковременной и долговременной гипоксии с последующей реоксигенацией при предварительном внутривенном введении нитрита натрия (за 10-15 мин до гипоксии). Сделаны выводы о том, может ли образование NO в ЭТЦ астроцитов из нитрита влиять на количество образующегося О2-, переходящего в перекись водорода, тем самым регулируя не только диаметр сосудов, но и образование АФК и АФК-опосредованную сигнализацию от астроцитов к нейронам. 2. Получены данные о соотношении связанного и свободного FAD, как показателя соотношения активностей окислительного фосфорилирования и гликолиза в астроцитах и нейронах соматосенсорной коры бодрствующих мышей при беге - физиологической нагрузке, сопровождающейся функциональной гипоксией. На основании полученных результатов сопоставлено, как степень загруженности ЭТЦ электронами коррелирует с образованием перекиси водорода в митохондриях и с переключением между гликолизом и окислительным фосфорилированием в астроцитах коры мозга бодрствующих мышей при физиологической гипоксии, вызванной бегом. 3. Получены данные о влиянии нитрита натрия на редокс-состояние комплексов ЭТЦ митохондрий и образование Н2О2 в астроцитах и нейронах в переживающих срезах мозга мышей при гипоксии различной длительности и реоксигенации. 4. Получены данные о влиянии ингибирования гликолиза на редокс-состояние комплексов ЭТЦ митохондрий, соотношение связанного и свободного FAD и образование Н2О2 в астроцитах и нейронах в переживающих срезах мозга мышей при гипоксии различной длительности и реоксигенации. 5. Получены данные о влиянии гипоксического прекондиционирования, предшествующего длительной системной гипоксии у анестезированных мышей, на редокс-состояние цитохромов ЭТЦ, образование Н2О2 в митохондриях астроцитов и нейронов и локальную оксигенацию крови в сосудах соматосенсорной коры во время 30-ти минутной гипоксии и через 1, 5, 10 и 30 мин после восстановления нормального содержания О2 во вдыхаемом воздухе. 6. Обобщение полученных данных. Устанолена корреляция между степенью загруженности различных участков ЭТЦ электронами, образованием H2O2 и соотношением активностей окислительного фосфорилирования и гликолиза в астроцитах и нейронах при системной гипоксии и реоксигенации и при предварительном внесении нитрита натрия. Установлена взаимосвязь между редокс-состоянием, локализацией и положением митохондрий в теле и отростках астроцитов и изменением локальной оксигенации крови и диаметром сосудов при системной гипоксии. Выявлена корреляция между редокс-состоянием ЭТЦ митохондрий астроцитов и нейронов, образованием Н2О2, изменением содержания ионов Са2+ в цитоплазме и митохондриях, а также окислением липидов и ДНК при острой локальной гипоксии, вызванной фотоповреждением сосудов коры мозга бодрствующих мышей. 7. Сформулировано заключение по поводу того, какие клетки мозга при каких условиях являются основными источниками АФК и NO и как это связано с общим редокс-состоянием ЭТЦ митохондрий, каким образом астроциты регулируют локальный кровоток и какие терапевтические процедуры могут быть направлены на снижение числа АФК, образующихся в астроцитах и/или нейронах после гипоксии. 8. По полученным результатам подготовлены статьи для публикации в ведущих зарубежных и российских журналах.
В данном проекте мы будем использовать разработанные нами подходы в экспериментах ex vivo и in vivo для изучения редокс-состояния цитохромов митохондрий в астроцитах и нейронах в переживающих срезах гиппокампа и соматосенсорной коре головного мозга мышей. Отработанные методики будут применены для оценивания степени оксигенации крови в сосудах соматосенсорной коры мозга анестезированных мышей при гипоксии и восстановлении нормоксии, а также у бодрствующих мышей при функциональной нагрузке. Отработанные методики будут применены для оценки степени оксигенации крови и диаметра сосудов соматосенсорной коры головного мозга анестезированных мышей при гипоксии и восстановлении нормоксии, а также у бодрствующих мышей в нормальных условиях и при локальной острой гипоксии, индуцированной фотоповреждением сосудов. В условиях in vivo были отработаны разные условия регистрации спектров мозга, включая острые и хронические эксперименты (инъекционный и газовый наркоз). В остром эксперименте животное находилось под действием внутрибрюшинной (рометар/золетил) анестезии, а на поверхность мозга в области открытой краниотомии производилась аппликация буферного раствора (PBS) для защиты нервной ткани от повреждения.Для проведения экспериментов на анестезированных мышах мы разработали и изготовили специальную платформу, совмещаемую со столиком микроскопа КР-микроспектрометра Renishaw (Великобритания) и позволяющую закрепить голову животного под объективом микроскопа и для осуществления подачи оксигенированной воздушной смеси от кислородного концентратора (Армед 8F-1, Россия) через специальную маску, располагающуюся на морде животного. У коллектива имеется разработанный подход для количественной оценки сатурации крови in vivo на основе спектров КР.Для коррекции базовой линии и анализа спектров КР мы используем пакет Pyraman для Python 3.
В ходе экспериментов, выполненных в течение всего проекта, будет проведен сравнительный анализ влияния гипоксии различного генезиса и постгипоксических условий на астроциты и нейроны, а также сосуды соматосенсорной коры мышей in vivo. Будет исследовано три типа гипоксий: (1) физиологическая гипоксия, связанная со снижением локального содержания О2 в соматосенсорной коре мозга мыши вследствие активного движения животного, (2) системная общая гипоксия, вызванная обратимым снижением содержания О2 во вдыхаемом воздухе и (3) острая локальная необратимая гипоксия, инициированная локальным фотоповреждением сосудов соматосенсорной коры мозга мыши. Будут получены новые данные о редокс-состоянии различных комплексов дыхательной цепи митохондрий и связанной с ними генерации АФК, будут оценены изменения конформационных и функциональных свойств цитохромов С, В и А-типов, определяющих скорость переноса электронов в ЭТЦ, и определены участки наибольшего накопления электронов, вносящие основной вклад в образование О2- и, следовательно, Н2О2 в митохондриях астроцитов и нейронов. Проведенные эксперименты также помогут установить взаимосвязь между состоянием комплексов ЭТЦ и накоплением Са2+ в матриксе митохондрий и оценить взаимное влияние изменений концентрации ионов Са2+ в цитоплазме и митохондриальном матриксе, редокс-состояния ЭТЦ митохондрий и образования Н2О2. Новизна перечисленных результатов заключается в том, они будут сопровождаться одновременно полученными данными о локальных изменениях диаметра сосудов и степени оксигенации крови в сосудах около исследуемых астроцитов и нейронов и, таким образом, установить характерные времена и последовательность событий, развивающихся в нейроастроваскулярном ансамбле при гипоксии и реоксигенации. Полученные данные позволят установить, в каком из типов клеток - астроцитах или нейронах - происходят наибольшие изменения в редокс-состоянии ЭТЦ митохондрий во время и после гипоксии и какие клетки являются основным источником АФК в мозге в постгипоксическом периоде. Влияние патологической гипоксии на редокс-состояние ЭТЦ митохондрий, генерацию АФК и динамику Са2+ в астроцитах и нейронах будет сопоставлено с изменениями, происходящими в данных типах клеток у мышей при беге - функциональных нагрузках, сопровождающихся физиологической гипоксией. Данные о редокс-состоянии ЭТЦ митохондрий, образовании H2O2 в астроцитах и нейронах и локальной оксигенации крови в сосудах коры мозга бодрствующих животных в покое и при движении будут получены впервые в мире и позволят сделать вывод о нейроастроваскулярных взаимодействиях в условиях естественного поведения. Предложенный нами методический подход, основанный на микроспектроскопии КР, для одновременной регистрации локальной оксигенации крови и редокс-состояния цитохромов дыхательной цепи митохондрий астроцитов и нейронов, существенно расширит экспериментальные возможности для изучения нейроглиоваскулярных взаимодействий и позволит установить корреляции между работой ЭТЦ и потреблением О2 из кровеносных сосудов при патологиях и действии различных веществ, в том числе, новых разрабатываемых лекарственных препаратах. Полученные данные в дальнейшем могут быть использованы для разработки процедур, направленных на снижение негативного влияния гипоксии и процессов постгипоксического периода на митохондрии нейронов и астроцитов при инсульте.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 12 апреля 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Роль метаболической пластичности астроцитов в регуляции нейроглиоваскулярных взаимодействий в неокортексе мышей при гипоксии in vivo |
Результаты этапа: Мы впервые разработали подход для in vivo мониторинга степени оксигенации крови в сосудах коры мозга мышей и для исследования редокс-состояния цитохромов дыхательной цепи (электронтранспортной, ЭТЦ) идентифицированных нейронов и астроцитов анестезированных или бодрствующих мышей (Рисунки 2 и 3А). Для идентификации нейронов и астроцитов были прведены операции по закалыванию в соматосенсорную кору вирусов, кодирующих гены GFP или NirFP под астроцит-или нейрон-специфическими кодонами, или вирусов, кодирующих ген HyPer 7 (так же под астроцит-или нейрон-специфическими кодонами) – биосенсора на перекись водорода, образующуюся в митохондриях. Спектры комбинационного рассеяния (КР) регистрировали от кровеносных сосудов и клеток в области соматосенсорной коры головного мозга анестезированных или бодрствующих мышей с имплантированными краниальными окнами. Для расчёта степени оксигенации крови был проведён калибровочный эксперимент, в ходе которого производился забор крови из хвостовой артерии животного и регистрация спектров КР при известных степенях насыщения крови кислородом в условиях in vitro. По результатам калибровки был получен поправочный коэффициент, использованный для расчёта степени оксигенации крови в сосудах головного мозга животного. sO2= (I1585*1.44)/(I1547+I1585*1.44)*100% По значению sO2 исследуемые сосуды разделяли на артериолы (оксигенация крови более 85%) и венулы (оксигенация крови менее 85-80%). На Рис. 4 показаны гистограммы локальной оксигенации крови в артериолах и венулах, рассчитанные при помощи предлагаемого нами подхода, полученные значения соответствуют тем, которые известны из литературных данных (Meshalkin EN, Vlasov IuA, Shishkina TN, Okuneva GN, Pinegin SL. Nasyshchenie krovi kislorodom v razlichnykh otdelakh krovenosnoĭ sistemy u zdorovogo cheloveka [Blood oxygen saturation in various regions of the circulatory system in healthy persons]. Kardiologiia. 1982 Nov;22(11):45-9; Collins JA, Rudenski A, Gibson J, Howard L, O'Driscoll R. Relating oxygen partial pressure, saturation and content: the haemoglobin-oxygen dissociation curve. Breathe (Sheff). 2015 Sep;11(3):194-201. doi: 10.1183/20734735.001415.). Мы получили, что спектры, зарегистрированные от нейронов и астроцитов, имеют сходную структуру, представляя собой набор пиков, характерных для восстановленных цитохромов ЭТЦ митохондрий, Phe-остатка в белках, липидах и пептидных связей в белках (Рис.5, таблица 1). При помощи разработанного нами подхода мы впервые показали, что в соматосенсорной коре у взрослых мышей митохондрии астроцитов содержат больше восстановленных цитохромов, чем митохондрии нейронов, что соответствует более высокой загруженности ЭТЦ астроцитов электронами по сравнению с нейронами. Более высокая заполненность ЭТЦ электронами является причиной генерации большего количества О2-. Полученный нами результат объясняет литературные данные о том, что митохондрии астроцитов являются источником бОльшего количества АФК, чем митохондрии нейронов [Lopez-Fabuel et al., PNAS 2016]. 1. Эффект кратковременной и длительной гипоксии и последующей реоксигенации на редокс-состояние митохондрий астроцитов и нейронов, а также на оксигенацию крови в артериолах и венулах. Показано, что кратковременная (2 мин) и долговременная (15 мин) гипоксия оказывают разное влияние на исследованные параметры, характеризующие редокс-состояние ЭТЦ митохондрий. Мы впервые показали, что при кратковременной гипоксии происходит увеличение относительного содержания восстановленных цитохромов С и В-типа относительно липидов (оценено по соотношению I750/I1440) в астроцитах, но не нейронах (Рис.6А), при этом реоксигенация - восстановление исходного уровня О2 во вдыхаемом воздухе - только после 5 минуты начинает снижать относительное содержание восстановленных цитохромов в астроцитах. Длительная (15ти минутная) гипоксия приводит к увеличению относительного содержания восстановленных цитохромов С и В-типов (I750/I1440) в митохондриях обоих типов клеток, однако при этом обнаруженное увеличение восстановленных цитохромов во все исследованные точки времени достоверно выше, чем в нейронах (Рис.6Б). Реоксигенация приводит к постепенному снижению содержания восстановленных цитохромов, на к 11 минуте их количество еще не доходит до исходного значения. Полученные данные свидетельствуют о том, что при кратковременной гипоксии ЭТЦ заполняется электронами только в астроцитах, а при длительной - и в нейронах, и в астроцитах, но в большей степени в астроцитах. В случае кратковременной гипоксии мы обнаружили слабо выраженную тенденцию к деоксигенации крови в венулах и незначительное снижение степени оксигенации крови в артериолах, в то время, как при длительной 15-ти минутной системной гипоксии наблюдается достоверное снижение оксигенации крови в сосудах обоих типов - в артериолах и венулах (Рис. 7, 8). Кроме того, оба типа гипоксий влияли на диаметр сосудов, приводя к их расширению (Рис. 9.А-В). Мы получили КР-карты, показывающие распределение по участку коры восстановленных цитохромов и дГб при нормоксии, 15ти мин гипоксии и через 15 мин после реоксигенации (Рис. 9А-В) Видно, что участки ткани около сосуда неоднородны по содержанию восстановленных цитохромов, что связано с тем, что регистрируемый сигнал идет от митохондрий и, таким образом, по КР-сигналу восстановленных цитохромов мы видим области локализации митохондрий. При гипоксии увеличивается относительное содержание восстановленных цитохромов в митохондриях, что видно, как увеличение интенсивности псевдоцвета, кодирующего соотношение I1126/I1440. Также видно, что при гипоксии увеличивается относительное содержание дГб в сосуде и увеличивается диаметр сосуда. При реоксигенации диаметр сосуда уменьшается, но при этом содержание восстановленных цитохромов не полностью возвращается к исходному уровню. Можно предположить, что астроциты даже при кратковременной гипоксии изменяют активность ЭТЦ и, следовательно, окислительного фосфорилирования и метаболизма в целом, чтобы обеспечить нейроны необходимой метаболической поддержкой. Так, при небольшом изменении - падении - локального содержания О2 в астроцитах может происходить переключение на гликолиз с продукцией лактата, который транспортируется в нейроны, переводится в пируват и используется в цикле Кребса для производства NADH (Machler et al., Cell Metabolism 2016). В этом смысле кратковременная гипоксия может выступать в роли непатологической гипоксии, похожей на локальную гипоксию, возникающую при функциональной нагрузке и активации нейрональных сетей. Астроциты в этом случае выступают в качестве “сенсоров” падения содержания О2 в тканях, меняя свой метаболизм таким образом, чтобы обеспечить лактатом нейроны. Нейроны при короткой гипоксии не меняют редокс-состояние своей ЭТЦ, а при длительной гипоксии снижение содержания кислорода в ткани мозга становится существенным, комплексу IV ЭТЦ начинает не хватать О2, в результате чего в ЭТЦ накапливаются электроны. Мы полагаем, что меньшее по амплитуде увеличение относительного содержания восстановленных цитохромов в ЭТЦ нейронов по сравнению с астроцитами связано с несколькими факторами: (1) ЭТЦ нейронов существует в виде суперкомплексов, а ЭТЦ астроцитов - в виде отдельно расположенных комплексов, в результате чего перенос электронов идет быстрее в ЭТЦ нейронов и кислород может использоваться более эффективно, чем в астроцитах. (2) При гипоксии астроциты переключаются на гликолиз, что дополнительно инактивирует ЭТЦ, приводя к накоплению в ней электронов. Мы предположили, что накопление электронов в ЭТЦ может приводить к генерации супероксид-анион радикала и формированию перекиси водорода, однако при кратковременной гипоксии мы не наблюдали изменение флуоресценции Hyper 7, что говорит об отсутствии изменений в образовании Н2О2. Мы показали, что спектры КР не демонстрируют изменений в спектральных диапазонах 1420-1440 и 800-1000 см-1, что может свидетельствовать об отсутствии окисления липидов и разрушения ДНК. Предположительно это связано с тем, что выбранные условия системной гипоксии являются достаточно мягкими для мыши, не приводя к серьезным повреждениям клеточных структур. Об этом также свидетельствует поведение мышей после экспериментов и отсутствие каких-либо следов повреждения мозга в последующие дни после гипоксии. 2. Изменение редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий астроцитов и образование перекиси в митохондриях астроцитов соматосенсорной коры мозга мышей при функциональной нагрузке - локомоции. Мы получили, что при первом акте беге, как и при груминге, обратимо увеличивается относительное содержание восстановленных цитохромов в астроцитах соматосенсорной коры мозга, что свидетельствует об увеличении числа электронов в ЭТЦ астроцитов (Рис. 10). При этом второй акт бега практически не влиял на данный параметр, что говорит о возможном развитии адаптации ЭТЦ митохондрий к данному состоянию. Кроме того, мы показали, что в ЭТЦ митохондрий астроцитов при обоих актах бега обратимо увеличивается генерация перекиси водорода (Рис. 11). Мы полагаем, что Н2О2 образуется вследствие переноса электрона на О2 с образованием О2- и последующим образованием Н2О2 под действием супероксиддисмутазы. Полученные данные подтверждают результаты о генерации перекиси водорода астроцитами, полученные другими авторами, в частности, группой проф. Хуана Боланоса (PNAS, 2016). Мы полагаем, что при кратковременной гипоксии или образуется меньшее количество перекиси,которая не детектируетcя при помощи HyPer 7, или образующийся супероксид-анион радикал дает другие активные формы кислорода, а не перекись. Мы полагаем, что обнаруженное нами накопление электронов в ЭТЦ астроцитов коры мозга мышей при вызванном беге связано с активацией гликолиза, производящего лактат, транспортирующийся в нейроны для обеспечения субстратами цикла Кребса и продукции большего количества NADH, необходимого для работы ЭТЦ и синтеза большего количества АТФ на АТФ-синтазе митохондрий. Для того, чтобы проверить, что при беге ткань мозга не испытывает гипоксию, в следующих этапах выполнения проекта мы проведем эксперименты по мониторингу степени оксигенации крови в сосудах кортекса при гипоксии, а также оценим редокс-состояние ЭТЦ нейронов. 3. Исследование уровня загруженности ЭТЦ митохондрий астроцитов электронами при острой локальной гипоксии, вызванной фототромбозом сосудов. Были получены данные о редокс-состоянии цитохромов типов С и В в ЭТЦ митохондрий астроцитов в условиях локальной гипоксии, индуцированной фототромбозом. В первый час после индукции фототромбоза наблюдалось снижение относительного количества восстановленных цитохромов В-типа относительно общего количества липидов в клетке c последующим повышением относительного количества восстановленных цитохромов В на первые сутки после фототромбоза, при этом относительное количество восстановленного цитохрома С увеличивалось уже через час (рис. 12.А и 12.Б соответственно). Повышения уровней этих параметров свидетельствует о более высокой степени загруженности ЭТЦ электронами. Это может быть связано с развитием условий локальной гипоксии: отток электронов на кислород с восстановленного цитохрома c через комплекс IV ЭТЦ оказывается затруднён. Наряду с этим могут активироваться альтернативные пути передачи электронов на АФК с комплекса III, кофактором которого является цитохром b, что может выражаться в снижении доли его восстановления. Через сутки после индукции фототромбоза наблюдалось восстановление относительного количества восстановленных цитохромов обоих типов до исходного уровня, а на вторые сутки – их снижение. При этом наблюдались различия в изменениях уровней загруженности ЭТЦ электронами на разных участках в ответ на функциональную нагрузку (вызванный бег). До введения бенгальского розового и в первые сутки после индукции фототромбоза выраженного ответа митохондрий астроцитов на уровне цитохрома В, содержащегося в III комплексе ЭТЦ, на локомоцию не наблюдалось (рис. 13.А-В). Однако через 48 часов после индукции фототромбоза было зафиксировано выраженное увеличение относительного количества восстановленного цитохрома В в ответ на оба эпизода локомоции (рис. 13.Г) с последующим снижением до исходного уровня в ходе периодов отдыха. Напротив, для цитохрома С наблюдался противоположный эффект. До индукции фототромбоза в ответ на локомоцию наблюдалось увеличение относительного количества восстановленного цитохрома c относительно общего количества липидов в клетке (рис. 14.А), причём в первый час после индукции фототромбоза амплитуда ответа на первый эпизод локомоции возрастала, и уровень его восстановления не снижался в ходе отдыха, что также может быть связано с недостатком кислорода и затруднением оттока электронов через комплекс IV (рис. 14.Б). При этом через сутки после индукции фототромбоза ответ на локомоцию на уровне цитохрома c пропадал и не восстанавливался через 48 часов. Получены данные о повреждении или гибели астроцитов по КР-сигналу продуктов окисления липидов и продуктов деградации ДНК через разные промежутки времени после индукции фотоповреждения сосуда. Так, на первые или вторые сутки после фототромбоза в спектрах КР появлялись плечи с положением 1420 см-1 у липидного пика с положением максимума 1440 см-1, а также выявлялись пики в области 800-1000 см-1, характерные для пуриновых и пиримидиновых оснований, которые, по всей видимости, появляются в цитоплазме при нарушении структуры ДНК. 4. Оценивание эффективности генерации перекиси водорода за счет фермента оксидазы D-аминокислот (DAAO). На данном этапе мы провели дополнительные работы, связанные с тестированием ферментативного окисления D-аланина и D-серина оксидазой D-аминокислот. Окисление указанных аминокислот ферментом приводит к образованию перекиси водорода [Kalinichenko et al., Redox Biology, 2023]. Данные работы были проведены, чтобы продемонстрировать in vitro работу фермента и сравнить его эффективность по отношению к двум аминокислотным субстратам. В дальнейшем, на третьем году выполнения проекта, мы планируем проводит инъекцию в кору вируса, несущего ген DAAO под астроцитарным или нейрональным промоторами для экспрессии DAAO в определенных клетках для направленной продукции Н2О2 и исследования редокс-состояния клеток при повышенной концентрации перекиси водорода. С использованием серебряных плазмонных наноструктур мы показали, что DAAO эффективнее окисляет D-аланин, чем D-серин, что важно в случае ее применения in vivo, поскольку в клетках мозга D-серин играет важную сигнальную роль. Полученные результаты опубликованы в журнале Биофизика (Бочкова и др. Биофизика, 2023). |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".