ИСТИНА

Проект направлен на проведение микробиологических, радиоизотопных и молекулярно-биологических исследований разнообразия и активности архей в аэробных водах, хемоклине и анаэробной водной толще глубоководной зоны Черного моря. Планируется провести 12-17-ти дневную экспедицию на борту научно-исследовательского судна ИО РАН, оснащенного необходимым оборудованием для прецизионного отбора образцов из различных гидрологических горизонтов водной толщи. В ходе экспедиции будут отобраны образцы для следующих видов анализов: (1) газо-гидрохимического исследования водной толщи, необходимого для выявления зон возможного развития разных физиологических групп архей; (2) радиоизотопного измерения скорости темновой фиксации углекислоты в сочетании с ингибиторным анализом и использованием специфических антибиотиков, а также определения скорости метаногенеза и окисления метана, позволяющего количественно оценить вклад архей в образование органического углерода и в процессы цикла метана на разных глубинах; (3) получения накопительных культур архей с дальнейшим определением их филогенетической принадлежности молекулярно-биологическими методами; (4) отбора и фильтрации образцов водной толщи для исследования популяции архей с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) c использованием 16S рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов на основные группы архей, а также для выделения тотальной ДНК из водной взвеси с последующей детекцией в ней архейной ДНК и генов, кодирующих специфичные архейные ферменты: 4-гидроксибутирил-СоА дегидратазу (4СDH), архейную аммониймонооксигеназу (amoA) и альфа-субъединицу метил-коэнзим М редуктазы (mcrA).

Отбор проб для гидрохимических, радиоизотопных, микробиологических и молекулярно-биологических исследований водной толщи проводили на глубоководных стациях, расположенных в нижней части континентального склона российского сектора Черного моря в интервале глубин 1850-2040 м. В мае образцы отбирали в районе г. Туапсе, а в августе и сентябре – в районе г. Новороссийска. Горизонты пробоотбора были выбраны на основе данных гидрологического зондирования, позволяющего с высокой точностью определить характерные для глубоководной зоны Черного моря гидрологические слои. Резкий склон в сочетании с особенностями вертикальных и горизонтальных перемещений водных масс в исследованном районе приводит к тому, что сероводородные воды здесь значительно заглублены по сравнению с центральной частью Черного моря. В мае появление следов сероводорода на ст. Г-15 с глубиной 1857 м отмечалось на глубине 135 м, а редокс-зона располагалась в интервале глубин 100-140 м. В августе на ст. Т-15 с глубиной 2040 м следы сероводорода регистрировались значительно глубже – на глубине 160 м, а редокс-зона находилась в интервале глубин 125-165 м. В сентябре почти в той же точке (ст. Г-16) появление сероводорода было зафиксировано на глубине 135 м, а редокс-зона располагалась на глубинах 100-140 м. В фотической зоне пробы воды отбирали с глубины 10, 14, 50 м; в холодном промежуточном слое (ХПС) – с глубины 90, 110 м; из верхней границы редокс-зоны, где практически полностью исчезает кислород (<3 мкМ) и появляются следы сероводорода – с глубины 130, 150 и 160 м и из верхней границы анаэробной зоны (190, 219 м), где кислород аналитически не определялся, а концентрация сероводорода достигала 20 мкМ. На борту судна образцы воды с соответствующих глубин разливали по стерильным склянкам и пластиковым емкостям для следующего вида анализов: (1) определения содержания О2, H2S, общей щелочности, нитратов, нитритов, аммония, Сорг и метана; (2) определения скоростей процессов темновой ассимиляции углекислоты, метанокисления и метанобразования радиоизотопным методом; (3) определение общей численности микроорганизмов с использованием флуоресцентной микроскопии, а также численности бактерий и архей методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Для проведения молекулярно-биологической детекции архей в водной толще Черного моря мы использовали разные фильтры, чтобы отделить крупную взвесь от свободноживущих клеток микроорганизмов. Отделение взвеси проводили на стекловолоконных фильтрах GF/C, задерживающих частицы размером более 1,2 мкм, с последующей фильтрацией образцов на фильтрах Merck Millipore (США) с диаметром пор 0,22 мкм. С каждого горизонта водной толщи фильтровали по 5 л морской воды. Фильтры помещали в фиксирующий буфер (TE/этанол, 1:1) и транспортировали в стационарную лабораторию для выделения тотальной ДНК. Для получения накопительных культур архей из аэробной водной толщи проводили фильтрацию 1 л воды с соответствующих горизонтов через мембранный фильтр Millipore (США) с диаметром пор 0,22 мкм и затем фильтр помещали в стерильную фильтрованную воду с добавлением 1 мМ хлорида аммония и по 100 мг/л антибиотиков ванкомицина и стрептомицина. Инкубацию проб с 14С мечеными метаном, бикарбоната и ацетата проводили непосредственно на борту судна при температуре, соответствующей условиям in situ.