ИСТИНА

На сегодняшний день, терапия пациентов с ММ ингибиторами протеасом хотя и зарекомендовала себя эффективной, но также показала, что она обладает сильным побочным действием из-за неспецифического действия ингибиторов как на нормальные, так и на раковые клетки. Соответственно, остро встает вопрос создания более адресных, персонифицированных терапий, основанных на сочетанной обработке разными препаратами, учитывающих статус как р53, так и других важных биомаркеров, у пациентов. В связи с этим, обнаружение новых специфических мишеней ММ приведет к созданию новых фармакологических препаратов, а также инновационных подходов сочетанных терапий для лечения этого заболевания. Такой комбинаторный подход позволит снизить дозы каждого принимаемого препарата по отдельности, тем самым снижая их неспецифическую токсичность, но при этом, повышая терапевтический эффект препаратов в целом. В рамках проекта планируется проведение сравнительного анализа изменений в экспрессии белков, вошедших в созданный нами «протеомный каталог» протеасомо-ассоциированных белков клеток ММ человека линии RPMI8226 по отношению к таковым из клеток другой линии ММ - Im-9 (в контроле и после сочетанной обработки доксорубицином и бортезомибом). Будет проведен биоинформатический анализ протеасомо-ассоциированных белков с целью поиска потенциальных новых препаратов для сочетанной терапии. По итогам скрининга планируется проведение обработок клеток ММ обнаруженными с его помощью химическими соединениями в сочетании с ингибиторами протеасом (бортезомиб, карфилзомиб) и ингибиторами белков теплового шока HSP70/HSP90, с последующим подбором оптимальных условий сочетанных терапий и оценкой их эффективности и цитотоксичности. Далее запланировано проведение протеомного анализа изменений в экспрессии протеасомо-ассоциированных белков (2D DIGE с последующей тандемной масс-спектрометрией) и подтверждение обнаружения белков-мишеней посредством иммуноблоттинга со специфическими антителами. На заключительном этапе работы планируется проведение анализа роли эндорибонуклеазы протеасом и идентифицированного нами при создании «протеомного каталога» протеасомо-ассоциированных белков белка-протектора мРНК, ELAVL1 в регуляции стабильности мРНК ключевых факторов онкогенеза в клетках.

To date, the therapy of patients with MM by proteasome inhibitors has proved to be effective, but has also shown that it has a strong side effect due to the nonspecific action of inhibitors on both normal and cancer cells. Accordingly, there is an urgent need to create more targeted, personalized therapies based on combined treatment with different drugs, taking into account the status of both p53 and other important biomarkers in patients. In this regard, the detection of new specific targets of MM will lead to the creation of new pharmacological agents, as well as innovative approaches of combined therapies for the treatment of this disease. Such a combinatorial approach will allow to reduce the doses of each taken preparation separately, thereby reducing their nonspecific toxicity, but at the same time, increasing the therapeutic effect of the preparations as a whole. Within the framework of the project, it is planned to carry out a comparative analysis of the changes in the expression of proteins included in the "proteomic catalog" of proteasome-associated proteins of human MM cells of the RPMI8226 line with those of other MM - Im-9 cells (in control and after combined treatment with doxorubicin and bortezomib). A bioinformatic analysis of proteasome-associated proteins will be conducted to find potential new drugs for combined therapy. Based on the results of the screening, it is planned to perform MM cell treatments with the chemical compounds detected with it in combination with proteasome inhibitors (bortezomib, carfilzomib) and heat shock protein inhibitors HSP70/HSP90, then selecting the optimal conditions for combined therapies and evaluating their effectiveness and cytotoxicity. Further, a proteomic analysis of changes in the expression of proteasome-associated proteins (2D DIGE followed by tandem mass spectrometry) and confirmation of the detection of target proteins by immunoblotting with specific antibodies is planned. At the final stage of the work, it is planned to conduct an analysis of the role of proteasome endonibonuclease and the mRNA protector protein, ELAVL1, identified by us in creating a "proteomic catalog" of the proteasome-associated proteins, in regulation of the stability of mRNAs for key oncogenesis factors in the cell.

На первом этапе планируется сравнительный анализ изменений в экспрессии белков, вошедших в созданный нами «протеомный каталог» протеасомо-ассоциированных белков клеток ММ человека линии RPMI8226 по отношению к таковым из клеток другой линии ММ - Im-9 (в контроле и после сочетанной обработки доксорубицином и бортезомибом). Следующая задача состоит в проведении биоинформатического анализа протеасомо-ассоциированных белков с помощью программного обеспечения http://www.bioprofiling.de/gene_list.html, которое позволяет соотнести интересующие нас белки с библиотекой проведенных скринингов против конкретных мишеней (белков) с последующим выводом списка соединений, которые показали активность против этих белков. По итогам скрининга планируется проведение обработок клеток ММ (линий RPMI8226 - p53-, Im-9 - p53+) обнаруженными с его помощью химическими соединениями в сочетании с ингибиторами протеасом (бортезомиб, карфилзомиб) и ингибиторами белков теплового шока HSP70/HSP90, с последующим подбором оптимальных условий сочетанных терапий. Эффективность и цитотоксичность сочетанных воздействий планируется оценивать посредством теста на МТТ и с помощью проточной цитометрии после обработки клеток антителами к аннексину V и окраски йодистым пропидием (оценка количества клеток, ушедших в апоптоз). После подбора оптимальных условий сочетанных обработок планируется проведение обогащения клеточных экстрактов короткоживущими регуляторными белками, ассоциированными с протеасомными комплексами, посредством аффинной хроматографии с иммобилизованными на глутатион-сефарозе белками слияния GST-UBD_HDAC6 и GST-PSMA3 (позволяющими получить совокупности белков-мишеней убиквитин-зависимого и независимого протеолиза, соответственно). Данные смеси белков будут подвергнуты дифференциальному мечению флюоресцентными красителями Cy3, Cy5 для последующего разделения в системе двумерного электрофореза (2D DIGE) высокого разрешения (I направление – изоэлектрическое фокусирование белков в полосках гелей с иммобилизованными градиентами рН на приборе Ettаn IPG Phor 3 (GE Healthcare), II направление – разделение белков по молекулярными массам с помощью электрофоретического оборудования Hoefer SE 600 Ruby). Анализ изменений в экспрессии белков будет проводиться на приборе Typhoon 9500 (GE Healthcare) на базе Ресурсного Центра СПбГУ. Интересующие нас пятна будут вырезаны из гелей, подвергнуты трипсинолизу с дальнейшим масс-спектрометрическим анализом на приборе AB Sciex 5800 TOF/TOF, имеющемся в лаборатории. Подтверждение обнаружения интересующих нас белков-мишеней будет проводиться с помощью иммуноблоттинга со специфическими антителами. На заключительном этапе работы планируется анализ роли идентифицированного нами при создании «протеомного каталога» протеасомо-ассоциированных белков белка-протектора мРНК, ELAVL1 (HuR) в регуляции стабильности мРНК ключевых факторов онкогенеза в клетках. Для этого запланировано создание плазмид, содержащих последовательности 3’-нетранслируемых областей генов-мишеней ELAVL1 (из числа выявленных нами в ходе протеомного анализа), под промоторами фаговых РНК-полимераз. На матрицах данных плазмид будет проведена транскрипция in vitro; полученные фрагменты РНК будут обработаны препаратами протеасом из клеток ММ в присутствии либо в отсутствие белка слияния GST-ELAVL1. Результаты, полученные на данном этапе, позволят пролить свет на проблему взаимодействия белка-протектора мРНК ELAVL1 и РНКазы протеасом в регуляции экспрессии генов на уровне стабильности мРНК.

Нами проведена идентификация и первичный анализ с помощью MALDI-TOF МS/MS белков в протеоме человека, которые могут участвовать в специфической модуляции цитотоксического эффекта сочетанной химиотерапии на опухолевые клетки MM. Несмотря на то, что протеасома расщепляет большинство белков по убиквитин-зависимому механизму, существует ряд белков, расщепляемых по убиквитин-независимому пути. В этом случае, потенциальные субстраты протеасомо-зависимой деградации взаимодействуют с субъединицей альфа7 (PSMA3) 20S комплекса. Проведенный нами МС анализ белков, взаимодействующих с субъединицей PSMA3, показал присутствие в пробах более 80 различных белков, участвующих в таких процессах, как транскрипция, трансляция, метаболизм РНК (в том числе, сплайсинг). Результаты MC анализа связывания белков клеток MM с протеасомной субъединицей альфа7 мы подтвердили иммуноблоттингом с антителами к белкам hnRNP A2/B1, K, L, C1/C2; ELAVL1, eeF1A, HSP70, GRP78, PSME1 и ACTG1. Нами показана неспособность белка GST к взаимодействию ни с одним из рассматриваемых белков. Cреди идентифицированных нами белков присутствует ELAVL1 — протектор мРНК ряда регуляторных белков клетки, способствующий стабилизации этих мРНК за счет связывания с AU-богатыми мотивами в их 3’-НТР. Поскольку протеасомы также способны узнавать AUUUA-мотивы и обладают РНКазной активностью (в т.ч. и субъединица PSMA3), они могут конкурировать в проявлении своих активностей, и белок HuR может рассматриваться в качестве потенциальной мишени протеасомного протеолиза. Накопление этого белка при подавлении протеасомной активности говорит в пользу его как белка-мишени для протеасом (в т.ч. для деградации по убиквитин-независимому пути). Таким образом, описанная нами панель белков представляет большой интерес для идентификации субстратов убиквитин-независимого протеолиза. Для подтверждения способа деградации, в дальнейшем нужно проверить данную гипотезу для каждого белка по отдельности уже в условиях другого эксперимента.

I год: По итогам сравнительного анализа изменений в экспрессии белков, вошедших в созданный нами «протеомный каталог» протеасомо-ассоциированных белков клеток ММ человека линии RPMI8226 по отношению к таковым из клеток другой линии ММ - Im-9 (в контроле и после сочетанной обработки доксорубицином и бортезомибом), мы расчитываем идентифицировать совокупности протеасомо-ассоциированных белков в клетках множественной миеломы, различающихся по статусу онкосупрессора р53 (линия RPMI8226 - p53-, линия Im-9 - p53+). Мы предполагаем, что запланированный нами биоинформатический анализ протеасомо-ассоциированных белков с целью поиска потенциальных новых препаратов для сочетанной терапии позволит разработать более адресные, персонифицированные терапии, основанные на сочетанной обработке разными препаратами, учитывающими статус как р53, так и других важных биомаркеров. По итогам скрининга мы расчитываем подобрать оптимальные условия сочетанных терапий клеток ММ (дозы препаратов, время обработки) химическими соединениями в сочетании с ингибиторами протеасом (бортезомиб, карфилзомиб) и ингибиторами белков теплового шока HSP70/HSP90 и оценить их эффективность и цитотоксичность посредством теста на МТТ и с помощью проточной цитометрии после обработки клеток антителами к аннексину V и окраски йодистым пропидием. II год: Результаты протеомного анализа клеточных экстрактов, обогащенных короткоживущими регуляторными белками, ассоциированными с протеасомными комплексами, проведенного посредством аффинной хроматографии с иммобилизованными на глутатион-сефарозе белками слияния GST-UBD_HDAC6 и GST-PSMA3, с последующим тандемным масс-спектрометрическим анализом, позволят получить совокупности белков-мишеней убиквитин-зависимого и независимого протеолиза после разработанных на первом этапе сочетанных терапий клеток множественной миеломы. Посредством иммуноблоттинга со специфическими антителами будут подтверждены результаты масс-спектрометрической идентификации белков-мишеней. Полученные данные позволят идентифицировать новые белковые маркеры, специфические для данного заболевания. III год: Результаты, полученные на данном этапе, позволят расширить известный к настоящему времени спектр мРНК-мишеней белка ELAVL1 и пролить свет на проблему взаимодействия белка-протектора мРНК ELAVL1 и РНКазы протеасом в регуляции экспрессии генов на уровне стабильности мРНК.