ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Актуальность проекта определяется важностью исследований фундаментальных механизмов регуляции процессов морфогенеза и регенерации для решения актуальных проблем современной фундаментальной биологии и прикладных задач регенеративной медицины. Одним из актуальных научных и практических аспектов этой темы является исследование механизмов регуляции процессов обновления, дифференцировки, межклеточной коммуникации и функционирования клеток жировой ткани. Помимо способности запасать липиды и жирные кислоты жировая ткань является важным эндокринным органом, секретирующим гормоны, и регулирующим все энергетические процессы в организме. Эндокринные, пищевые расстройства, а также генетические факторы могут приводить к дисфункции жировой ткани, изменению профиля экспрессии адипокинов, потере чувствительности к гормональным и паракринным факторам, провоцируя метаболические нарушения, ожирение и диабет 2 типа. Целью проекта является проведение комплексных исследований для выяснения основных физиологических механизмов обновления и дифференцировки стволовых/прогениторных клеток жировой ткани с участием Ткадгерина. Научная новизна проекта определяется предложенной нами гипотезой об участии Т-кадгерина на основе его взаимодействия с известными лигандами - липопротеидами низкой плотности (ЛНП) и адипонектином - в регуляции компартмента недифференцированных клеток жировой ткани, их пролиферации и адипоцитарной дифференцировки. Проверка этой гипотезы принципиально важна для понимания фундаментальных механизмов регуляции иерархической организации в популяции МСК и поддержания гомеостаза жировой ткани в норме в связи с тем, что изменение экспрессии или функционирования Т-кадгерина, а также ряд описанных полиморфизмов человека в гене Ткадгерина (CDH13) характерны для людей с метаболическими нарушениями. Преимуществом представленного проекта является сочетание биологических методов с технологиями Заявка № 23-11-00205 Страница 2 из 82 биоинформатического анализа, современных высокопроизводительных вычислительных систем, технологий анализа Больших данных и искусственного интеллекта, представляющих в настоящее время наиболее эффективные подходы к анализу комплексной молекулярно-биологической информации. В целом результаты данного проекта будут оригинальными, не имеющими фактически аналогов в мире и будут представлять существенный прогресс в исследованиях ключевых механизмов обновления клеток, регенерации органов и тканей для будущих прорывных биологических и медицинских технологий.
The proposed project is planned within the framework of the main scientific direction at Faculty of Fundamental Medicine of Moscow State University by M.V. Lomonosov, founded by Academician of the Russian Academy of Sciences, Doctor of Biological Sciences, Professor Tkachuk V.A. The relevance of the proposed project is determined by the importance of studying the fundamental mechanisms of morphogenesis and regeneration to solve the urgent problems of modern fundamental biology and applied regenerative medicine. One of the topical scientific and practical aspects in this field is the study on the regulatory mechanisms of cell renewal, differentiation, intercellular communication and functioning of adipose tissue cells. In addition to the ability to store lipids and fatty acids, adipose tissue is an important endocrine organ that secretes hormones and regulates all energy processes in the body. Endocrine, nutritional disorders, as well as genetic factors can lead to dysfunction of adipose tissue, changes in the expression profile of adipokines, loss of sensitivity to hormonal and paracrine factors, provoking metabolic disorders, obesity and type 2 diabetes. The aim of the project is to conduct comprehensive studies to elucidate the main physiological mechanisms of renewal and differentiation of stem/progenitor cells in the adipose tissue with a special emphasis on T-cadherin. The scientific novelty of the project is determined by our hypothesis on the pivotal role of T-cadherin as a receptor of its well-known ligands - low density lipoproteins (LDL) and adiponectin - in the regulation of the compartment of undifferentiated adipose tissue cells, their proliferation, adipocyte differentiation and secretory activity. Verification of this hypothesis is fundamentally important for understanding the mechanisms of hierarchical organization in the MSC population and maintaining adipose tissue homeostasis in normal and pathological conditions due to the fact that changes in the expression or functioning of T-cadherin, as well as a number of described human polymorphisms in the T-cadherin gene (CDH13) has been detected in patients with metabolic disorders and obesity. Modern biomedical research is known for accumulation tremendous amount of information, warranting for innovative approaches based on modern computing technologies and modern high-performance computing systems. Modern computing systems of high and ultra-high performance, parallel computing systems of high and ultra-high performance, including those available at university levels, open up new opportunities for progress in the related fields of biology and medicine. In the program for the development of computer systems and information technologies, biological research is among the most relevant and promising areas. Currently, the development of computing systems allows for effective solutions of the Big Data analysis and effective methods for the analysis of biological research results. The advantage of the presented project is the combination of biological methods with bioinformatics, modern highperformance computing systems, Big Data analysis and artificial intelligence technologies, which are currently the most effective approaches to the analysis of complex molecular biological information. In general, the results of the project will be original, having virtually no analogues in the world and will represent a significant progress on the key mechanisms of cell renewal, organ and tissue regeneration for the future breakthrough biological and medical technologies.
В процессе выполнения проекта ожидаются важные научные результаты в области исследования фундаментальных механизмов морфогенеза жировой ткани, регуляции процессов обновления клеточного состава, дифференцировки, межклеточной коммуникации и ее функционирования на основе современных методов биоинформатики в области структурной биологии в сочетании с методами клеточной, молекулярной биологии и биохимии. - Одним из основных результатов предлагаемых исследований является создание инновационных методов и инструментов накопления и детального анализа цитологической и молекулярно-биологической информации о важнейших биологических процессах, таких как морфогенез и регенерация с ключевым влиянием Т-кадгерина, рецептора адипонектина - основного гормона жировой ткани. Для проведения предлагаемых исследований будут Заявка № 23-11-00205 Страница 3 из 82 разработаны новейшие методы биоинформатики, структурной биологии и математического моделирования. Данные, полученные с использованием биоинформационных и математических методов анализа информации, позволят провести дальнейшие биохимические, клеточные и молекулярно-биологические исследования: - Созданные в рамках предлагаемых исследований методы и инструменты анализа будут использованы согласно стандартам международных биоинформатических баз данных, позволяющие непосредственный анализ и сравнение полученных результатов с мировым уровнем. Биоинформационные данные, полученные в ходе выполнения предложенного проекта, будут представлены для включения в международный биоинформационный реестр и базу данных образцов ведущей мировой биотехнологической компании 10XGenomics. - Будет создана коллекция образцов и соответствующая информационная база мезенхимных стволовых клетках (МСК) из подкожной жировой ткани человека, выделенных и культивированных в стандартных условиях или в условиях индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении. Для выявления роли Т-кадгерина в адипогенной дифферецнировке будет проведен транскриптомный анализ МСК человека (scRNAseq) до и после индукции дифференцировки в адипоциты и широкомасштабный анализ данных секвенирования (библиотеки на платформе «10x Chromium», секвенирование - на платформе IlluminaNovaSet 6000) с последующим биоинформационным анализом полученных результатов. Выявление сигнальных путей будет произведено с использованием баз данных http://geneontology.org/ и https://www.genome.jp/kegg/pathway и эффективных методов анализа биоинформационных данных, В результате детального анализа будут получены новые фундаментальные знания об иерархической структуре популяции МСК, включая вновь выявляемые функциональные субпопуляции, и выяснение роли Т-кадгерина в обновлении и дифференцировки клеток жировой ткани. - Эффективность адипоцитарной дифференцировки в зависимости от экспрессии Т-кадгерина будет оценена по накоплению липидных капель в клетках с помощью гистологического окрашивания Oil Red O, а также с помощью анализа экспрессии маркеров преадипоцитов и зрелых адипоцитов методом количественной RT-PCR следующих генов: DPP4, PPARG, C/EBPalpha, C/EBPbeta, CD142, CLEC11A, LEP, ADIPOQ, PLIN1, FoxO1. Результаты будут проанализированы и сопоставлены с данными биоинформационного анализа международной биоинформационной базы данных scRNAseq. Количественная оценка клеток, несущих маркеры адипоцитов, будет проведена путем подсчета доли клеток методом проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии. - На основе детального биоинформационного анализа впервые будет проверена гипотеза о существовании функциональных субпопуляций и взаимосвязи экспрессии Т-кадгерина и инсулинового рецептора IR с использованием методов иммуносортинга, RT-PCR, вестерн блоттинга, что важно для понимания роли Т-кадгерина в регуляции чувствительности популяции к инсулину и инсулин-зависимой сигнализации, а также дифференцировке клеток жировой ткани. - Будет проведено скрещивание мышей с флоксированным геном Т-кадгерина с Cre-мышами, будет исследован генотип и фенотип полученных мышей F2 поколения с целью выявления полноразмерной или транкированной форм Ткадгерина (или подтверждения нокаута). Будут получены биоданные тестов на мышиных клетках с использованием методов RT-PCR, флуоресцентной микроскопии и вестерн блоттинга. Функциональные свойства форм Т-кадгерина впервые будут оценены по способности МСК мышей с разными вариантами Т-кадгерина к адипогенной дифференцировке, активации внутриклеточной кальциевой сигнализацией в ответ на добавление лигандов (метод прижизненной флуоресцентной микроскопии на одиночных клетках). - Впервые будет проведен биоинформационный анализ и поиск аналогичной изоформы Т-кадгерина у человека с акцентом на предсказание ее молекулярных, биохимических и физиологических свойств. Методами структурной биологии и математического моделирования будет получена информация о пространственной структуре Т-кадгерина (полноразмерная и транкированная формы) и представлена ее визуализация. Будут выявлены карманы и сайты связывания лигандов Т-кадгерина, получена информация о распределении поверхностных зарядов структуры Ткадгерина, что позволит получить расширенное представление об отличиях между полноразмерной и транкированной формой и предсказать физиологическую релевантность этих различий. Будет проведено изучение распределения поверхностных зарядов структуры Т-кадгерина в силовом поле. Методами структурной биологии будет проведен анализ структуры Т-кадгерина полноразмерной и транкированной формы и определены наиболее вероятные сайты связывания лигандов (Молекулярный докинг). Будет построено филогенетическое дерево для Т-кадгерина человека и Заявка № 23-11-00205 Страница 4 из 82 мыши. - Для проверки гипотезы о существовании регуляции по принципу обратной связи с участием Т-кадгерина, будет проанализирована способность мышиных МСК с разными вариантами Т-кадгерина к адипогенной дифференцировке в присутствии лигандов (ЛНП и разных форм адипонектина). - Для ответа на вопрос, является ли Т-кадгерин самостоятельным рецептором или функционирует как ко-рецептор, будет использован метод ко-иммунопреципитации. Для анализа возможного взаимодействия Т-кадгерина с LDLR и AdipoR1/2 на мембране клеток будут использованы антитела к Т-кадгерину, лизаты МСК и 3T3L1 клеток, (линия фибробластов, коммитированных в преадипоциты) с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина после плазмидной трансфекции и селекции на антибиотике, а также лиганды Т-кадгерина - ЛНП и адипонектин. - Впервые будет проведена идентификация внутриклеточных сигнальных путей, регулируемы активностью или экспрессией Т-кадгерина, а также его лигандов. Будет проведен анализ сигнальных путей с участием AMPK, mTOR, APPL, p38MAP, Erk, PI3K, активируемых через Т-кадгерин, методом вестерн-блота. Используя веб-ресурсы KEGG и String будут реконструированы сигнальные пути, ассоциированные с Т-кадгерином и биологическими процессами, в которых будет выявлено участие Т-кадгерина методами биоинформатического анализа. Все полученные результаты будут проанализированы методами биоинформационного анализа. Предложенные методы и подходы биоинформационных исследований ключевых биологических процессов на основе Т-кадгерина позволят получить фундаментальные знания, имеющие прикладное значение для регенеративной медицины с высоким потенциалом широкого практического применения и формирования новых научных направлений. В дальнейшем будут предложены методики практического применения в регенеративной медицине для коррекции метаболических нарушений, в частности ожирения и сопутствующих заболеваний.
У коллектива есть опыт биоинформатического анализа массивов данных транскриптома на одиночных клетках (scRNAseq) и секретируемых ими внеклеточных везикул (Arbatsky et al., 2019), а также создания библиотек, секвенирования и обработки результатов анализа данных “bulk” scRNAseq. , GOstats(Bioconductor) и биоинформатических ресурсов GeneOntology, KEGG, CellMarker и PanglaoDB. В сотрудничестве с математиками, биоинформатиками и биологами в нашем коллективе был разработан метод построении графиков в координатах компонент, гены которых высоко экспрессированы и отражают определенные биологические процессы (Arbatsky et al., 2022). Коллектив владеет современными вычислительными технологиями, включая технологии Больших данных и технологии искусственного интеллекта, представляющих в настоящее время наиболее эффективные подходы к анализу комплексной молекулярно-биологической информации. В нашем коллективе работы по изучению функционирования Т-кадгерина в сердечно-сосудистой системе в норме и при патологии начались под руководством академика В.А. Ткачука более 25 лет назад. Т-кадгерин был выделен и идентифицирован как рецептор ЛНП (Tkachuk et al, 1998; Stambosky et al, 1999), а позднее Рубиной и соавторами были доказаны физиологическая значимость этого связывания (Rubina et al., 2005). Мы предположили гипотезу конкурентного взаимодействия между двумя лигандами за связывание с Т-кадгерином (Рубина и др., 2017; Balatskaya et al., 2019). Нашим коллективом была осуществлена подробная характеристика отдельных субпопуляций МСК и проведены исследования по выявлению их роли в процессах адипогенной дифференцировки в онтогенезе (Sysoeva et al., 2017, Тюрин-Кузьмин и др 2019а,b). На базе Московского Университета создан Национальный банк-депозитарий живых систем https://human.depo.msu.ru/#. Коллектив имеет опыт разработки вирусных и плазмидных конструкций МСК для изменения экспрессии генов, редактирования генома (Karagyaur et al, 2021, Semina et al., 2020).
В ходе выполнения проекта с целью идентификации роли Т-кадгерина в процессах морфогенеза жировой ткани будут проведены комплексные исследования, сочетающие новейшие методы биоинформатического анализа, структурной Заявка № 23-11-00205 Страница 63 из 82 биологии, математического моделирования и методы клеточной, молекулярной биологии и биохимии. На начальном этапе будет произведено скрещивание мышей с флоксированным геном Т-кадгерина с Cre-мышами и генотипирование мышей F2 поколения. Методами молекулярной биологии и биохимии будет исследован генотип полученных мышей, в том числе методами RT-PCR с использованием специфических праймеров к полноразмерной и транкированной формам Т-кадгерина. Функциональные свойства изоформы Т-кадгерина будут оценены по способности МСК таких мышей к адипогенной дифференцировке, а также по способность ГМК и фибробластов реагировать кальциевой сигнализацией (метод прижизненной флуоресцентной микроскопии одиночных клеток) в ответ на добавление лиганда ЛНП. Будет изучен потенциал МСК с разными формами Т-кадгерина к адипогенной дифференцировке в присутствии лигандов Т-кадгерина (ЛНП и разных форм адипонектина). Все полученные результаты будут проанализированы методами биоинформатического анализа. Будет проведен детальный биоинформационный анализ изоформы Т-кадгерина у мышей и поиск аналогичной изоформы у человека с акцентом на предсказание молекулярных, биохимических и физиологических особенностей такого варианта Т-кадгерина. Биоинформатическими Биоинформационными методами будет проведено выравнивание и сравнение последовательностей человека и мыши (полноразмерной и транкированной форм), будет подсчитан процент совпадения последовательностей. Планируется получить информацию о пространственной структуре Ткадгерина и представить ее визуализацию. Будут выявлены карманы и сайты связывания лигандов Т-кадгерина (ЛНП и высокомолекулярный адипонектин), а также проведено изучение распределения поверхностных зарядов структуры Ткадгерина, что позволит получить расширенное представление об отличиях между полноразмерной и транкированной формой и предсказать физиологическую релевантность этих различий. 2024 год - Для ответа на вопрос о биологической значимости обнаруженных аминокислотных замен в структуре Т-кадгерина биоинформационный анализ будет продолжен и планируется построить филогенетическое дерево для Т-кадгерина человека и мыши. Планируется создание коллекции образцов МСК из подкожной жировой ткани человека, выделенных и культивированных в стандартных условиях или в условиях индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении. Будет проведен транскриптомный анализ МСК человека (scRNAseq) до и после их дифференцировки в адипоциты (суммарно от 2 здоровых доноров) и широкомасштабный биоинформатический биоинформационный анализ данных секвенирования. Подготовка библиотек транскриптов клеток МСК до и после их дифференцировки будет осуществлена на платформе «10x Chromium», секвенирование одиночных клеток — на платформе IlluminaNovaSet 6000 с последующим биоинформатическим анализом полученных результатов (описано выше). Выявление сигнальных путей будет произведено с использованием баз данных http://geneontology.org/ и https://www.genome.jp/kegg/pathway. В результате будут получены новые фундаментальные знания об иерархической структуре популяции МСК, включая вновь выявляемые фенотипические и функциональные особенности, и роли Т-кадгерина в обновлении клеток в жировой ткани. Для подтверждения данных биоинформатического анализа о роли Т-кадгерина в регуляции процессов дифференцировки МСК в адипогенном направлении, МСК человека с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина будут индуцированы в адипоциты. Способность к адипоцитарной дифференцировки будет оценена по накоплению липидных капель в клетках (окрашивания Oil Red O) и по экспрессии маркеров преадипоцитов и зрелых адипоцитов методом RTPCR (гены DPP4, PPARG, C/EBPalpha, C/EBPbeta, CD142, CLEC11A, LEP, ADIPOQ, PLIN1, FoxO1) и экспрессии инсулинового рецептора на поверхности клеток методом проточной цитофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии и Вестерн блот анализа. Планируется биоинформационный анализ генотипа мышей с транкированной формой Ткадгерина. Для получения МСК с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина будут созданы лентивирусные конструкции, содержащие кДНК Т-кадгерина человека, и контрольный лентивирус. Для визуализации трансдукции в вирусы будут закодированы последовательности флуоресцентных белков (mKate2 или GFP). Будут подобраны оптимальные условия селекции МСК для получения клеток с максимальной экспрессией Т-кадгерина. Планируется оценить влияние вирусной трансдукции для гиперэкспрессии Т-кадгерина на процессы адгезии и пролиферации, а также на способность МСК клеток дифференцироваться в адипогенном направлении. 2025 год – Заявка № 23-11-00205 Страница 64 из 82 Инструментами современных вычислительных технологий и методами структурной биологии будет проведен анализ структуры Т-кадгерина полноразмерной и транкированной форм и определены наиболее вероятные сайты связывания лигандов (молекулярный докинг), что позволит построить соответствующие математические модели и расширит фундаментальные знания о структуре и функции Т-кадгерина. Для определения латеральных взаимодействий Т-кадгерина с другими рецепторами будет использован метод коиммунопреципитации. Для доказательства существования взаимодействия Т-кадгерина с LDLR и AdipoR1/2 на мембране клеток нами предварительно была отработана методика ко-иммунопреципитации с использованием антител к Ткадгерину, лизатов МСК и 3T3L1 клеток, (линия фибробластов, коммитированных в преадипоциты) с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина после трансдукции или плазмидной трансфекции с последующей селекцией на антибиотике; подобраны условия лизиса клеток в зависимости от времени инкубации с лигандами ЛНП и адипонектином (низкомолекулярным и высокомолекулярным). Все полученные результаты будут проанализированы методами биоинформатического анализа. Также будет проведена идентификация внутриклеточных сигнальных путей, характерных для клеток, индуцированных в адипоцитарном направлении, и регулируемых активностью и экспрессией Т-кадгерина, а также его лигандов. Будет использован метод вестерн-блота лизатов клеток и антитела к сигнальным белкам AMPK, mTOR, APPL, p38MAP, Erk, PI3K. Используя веб-ресурсы KEGG и String будут реконструированы сигнальные пути, ассоциированные с Т-кадгерином и биологическими процессами, в которых будет выявлено участие Т-кадгерина методами биоинформатического анализа. В полученных в результате РНК-секвенирования массивах данных биоинформатическими методами анализа планируется идентифицировать пре-микроРНК, экспрессия которых изменяется при индукции адипогенной дифференцировки МСК человека, и предсказать зрелые микроРНК в кластерах клеток, экспрессирующих Т-кадгерин. В обнаруженных пре-микроРНК при помощи программы MatureBayes будут идентифицированы места расщепления шпилечной структуры ферментом Drosha и предсказаны зрелые микроРНК. Методом RT-PCR предсказанные микроРНК будут верифицированы, далее будет оценено влияние Т-кадгерина на их экспрессию в культуре МСК. Для этого микровезикулы/экзосомы, секретируемые клетками МСК с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина, будут выделены из среды культивирования через 48 часов кондиционирования с использованием центрифужных концентраторов Vivaspin VS2061 с диаметром пор 1000 кДа. Фракция малых РНК будет выделена набором Zymo research R1019/Invitrogen AM1561. Далее будет проведен количественный анализ микроРНК методом RT-PCR набором TransScript® Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix, обеспечивающий синтез кДНК и RTPCR. Для разделения реакций обратной транскрипции и полимерной цепной реакции будут использованы наборы miRCURY LNA RT Kit Cat. No./ID: 339340 и miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (200) Cat. No./ID: 339345. Все полученные результаты будут проанализированы методами биоинформатического анализа. В рамках предлагаемых исследований, методы и инструменты анализа с использованием биоинформатики, структурной биологии и математического моделирования будут согласованы со стандартами международных биоинформатических баз данных, что позволит провести релевантный анализ и сравнение полученных результатов с находящимися в открытом доступе базами данных. Полученные данные будут включены в международную базу данных, в частности ведущей мировой биотехнологической компании 10XGenomics.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 15 мая 2023 г.-31 декабря 2023 г. | этап 1 |
Результаты этапа: Разработаны новейшие биоинформатические методы и алгоритмы для анализа результатов клеточных и молекулярно-биологических исследований. Созданы биоинформатические базы данных с классификацией ключевых результатов на основе современных статистических методов. Разработаны и реализованы математические методы и инструменты анализа на основе современных вычислительных технологий, включая технологии Больших данных. Создана и фенотипически описана линия мышей Cdh13∆Exon3, у которых отсутствует экзон 3 в гене Cdh13. Молекулярно-биологическими и биохимическими методами исследован фенотип нокаутных мышей. Обнаружено, что общая морфология, продолжительность жизни и способность к размножению мышей Cdh13∆Exon3 находились в пределах нормы, в то время как масса тела была значительно ниже по сравнению с особями дикого типа (WT). Время бега и расстояние, пройденное мышами Cdh13∆Exon3 на беговой дорожке, было аналогично таковому у WT. Артериальное давление в состоянии покоя у мышей Cdh13∆Exon3 было несколько выше, чем у WT, однако при интенсивной физической нагрузке их систолическое артериальное давление было значительно выше. В то время как содержание адипонектина в миокарде мышей Cdh13∆Exon3 и WT было сопоставимым, уровень адипонектина в плазме был в 4,37 раза выше у мышей Cdh13∆Exon3. Помимо этого, интенсивные физические тренировки усиливали фосфорилирование AMPK в скелетных мышцах и миокарде мышей Cdh13∆Exon3 по сравнению с WT. Наши данные указывают на критически важную роль Т-кадгерина в регуляции артериального давления и выносливости у мышей, что может пролить свет на механизм патогенеза гипертонии. По результатам первой части работы по генотипированию опубликована работа в высокорейтинговом журнале. Полученные данные по иммуноцитохимическому окрашиванию клеток и жировой ткани полученной линии мышей указывают на присутствие в клетках Т-кадгерина, однако работы по сигнализации в присутствии лигандов Т-кадгерина выявили принципиальную разницу в кальциевом ответе клеток, что свидетельствует о нарушении функционального взаимодействия рецептор/лиганд в клетках полученной нокаутной линии. На следующем этапе планируется подробно исследовать особенности транкированной изоформы Т-кадгерина методом Вестерн блоттинга с различными антителами к Т-кадгерину и анализ цитоплазматической, мембранной и ядерной фракции на присутствие изоформ Т-кадгерина для ответа на вопрос о компартментализации и функциональных характеристиках исследуемого белка в клетках разных тканей мышей полученной линии. Известно, что нарушение экспрессии или функционирования Т-кадгерина, а также ряд описанных полиморфизмов человека в гене Т-кадгерина (CDH13) характерны для людей с метаболическими нарушениями, ожирением, диабетом 2 типа, что позволяет предположить важную роль Т-кадгерина в обменных процессах. Разработка моделей in vivo и in vitro с различными вариантами Т-кадгерина представляется перспективной для изучения фундаментальных механизмов возникновения метаболических нарушений и нарушений функционирования жировой ткани. Выполнено масс-спектрометрическое исследование образцов сердца и почки мышей линии Cdh13∆Exon3 и мышей дикого типа (WT). Используя метод ПААГЭ были выделены белки, которые по нашей гипотезе соответствуют различным изоформам Т-кадгерина. Метод трипсинолиза был использован для получения отдельных пептидов образцов Т-кадгерина для анализа методом времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией по методу МАЛДИ. В трипсинизированных образцах с использованием алгоритма Mascot нами были определены аминокислотные последовательности пептидов. Было выполнено выравнивание последовательностей идентифицированных пептидов на белковую последовательность Т-кадгерина, что позволило сделать вывод о наличии зрелых форм Т-кадгерина в образцах, полученных от животных WT. Обнаружено, что пептиды WT образцов покрывают только начальные участки белка. Выравнивание на ген Т-кадгерина позволило обнаружить, что WT образцы соответствуют зрелой форме и экспрессируют зрелую мРНК, которая содержит первый, второй, третий и десятый экзоны гена Т-кадгерина Выравнивание на ген Т-кадгерина пептидов полученных при процессинге нокаутных образцов (Cdh13∆Exon3) показало, что мРНК не переходит в зрелую форму поскольку третий экзон отсутствует, и пептидная последовательность покрывает исключительно первый и второй экзоны. Полученные экспериментальные результаты указывают на возможную экспрессию Т-кадгерина в нокаутных организмах Cdh13∆Exon3, однако идентификация пептидов затруднена в виду низкого содержания фрагментов данного белка и, по видимому, его активным протеолизом в протеасомах по причине неполной последовательности. Функциональные особенности изоформы Т-кадгерина изучены цитологическими методами: с целью выяснить, влияет ли модификация гена Т-кадгерина на его экспрессию и локализацию в различных клеточных компартментах проведен анализ локализации Т-кадгерина в различных субклеточных фракциях разного типа клеток, выделенных из мышей дикого типа (WT) и мышей линии Cdh13∆Exon3 методом вестерн блоттинга. В ходе выполнения работы нам удалось обнаружить изоформу Т-кадгерина с молекулярной массой около 80-85 кДа. Используя кальциевый сенсор - флуоресцентный зонд Fura-2 и прижизненную флуоресцентную микроскопию на одиночных клетках было продемонстрировано достоверное снижение амплитуды Са2+ответа при добавлении лиганда Т-кадгерина - ЛНП (70µg/ml) к фибробластам выделенным из тканей мышей линии Cdh13∆Exon3 по сравнению с клетками мышей дикого типа. Структурные механизмы взаимодействия Т-кадгерина с ЛНП и высокомолекулярным адипонектином на данный момент плохо изучены. Полученная линия мышей Cdh13∆Exon3, будет служить удобной моделью для изучения свойств Т-кадгерина и его изоформ in vivo, а также позволят провести аналогии с известными полиморфизмами Т-кадгерина у человека, что послужит основой для диагностики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и метаболических нарушений. Проанализирована способность МСК, выделенных из жировой ткани мышей линии Cdh13∆Exon3 к спонтанной адипогенной дифференцировке и адипогенной дифференцировке в условиях индукции коктейлем факторов (0.5 мM изобутиметилксантина, 1 μM дексаметазона, 5 μg/мл инсулина). Эффективность адипоцитарной дифференцировки оценивали по накоплению липидных капель в клетках с помощью гистологического окрашивания Oil Red O с последующей статистической обработкой полученных результатов. Обнаружено, что МСК, выделенные из подкожной жировой ткани мышей линии Cdh13∆Exon3 накапливают жировые капли при культивировании в плотном монослое, т.е. способны к спонтанной адипогенной дифференцировке. При использовании коктейля факторов, индуцирующих адипогенную дифференцировку, клеток с большими жировыми каплями становится значительно больше по сравнению с популяцией МСК, выделенных у животных дикого типа. Для проверки гипотезы о существовании петли регуляции по принципу отрицательной обратной связи способность МСК, выделенных из контрольных мышей и экспрессирующих транкированный Т-кадгерин, к адипогенной дифференцировке исследована в присутствии лигандов Т-кадгерина - ЛНП (70µg/ml) и HMW адипонектина (25µg/ml) в течение 5 дней. Проведенное исследование показало, что высокомолекулярный адипонектин не изменяет характер адипогенной дифференцировки МСК, выделенных из мышей линии Cdh13∆Exon3(Т-/-), по сравнению с такими же клетками, выделенными из контрольных мышей(с57) и экспрессирующими Т-кадгерин. В тоже время ЛНП подавляют адипогенную дифференцировку в контрольных клетках, что говорит об участии Т-кадгерина в адипогенезе. Любопытно, что в МСК, выделенных из мышей линии Cdh13∆Exon3(Т-/-) процент дифференцированных клеток также несколько снижен при действии LDL. Вероятно, структурные изменения Т-кадгерина у нокаутных животных все же позволяют функциональное взаимодействие Т-кадгерина с одним из лигандов. Проведен детальный биоинформационный анализ изоформы Т-кадгерина у мышей и поиск аналогичной изоформы у человека с акцентом на предсказание молекулярных, биохимических и физиологических особенностей такого варианта Т-кадгерина. В базах данных были найдены последовательности Т-кадгерина мыши и человека. После определения рамок считывания была смоделирована транкированная форма Т-кадгерина для человека. Поиск изоформы Т-кадгерина человека, ортологичной транкированной изоформе мыши проводили поиском нуклеотидной последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши и обнаружили, что последовательности, ортологичные последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши, у человека на всей своей длине полностью отсутствовала в 4 изоформе. Схожесть составила 68% для всей длины последовательностей и 95% для общего участка. Общий участок был получен как субвыравнивание из первоначального выравнивания MUSCLE транкированной изоформы мыши и 4 изоформы человека со стандартными параметрами. Для предсказания фолдинга транкированной изоформы Т-кадгерина мыши использовали ColabFold, имплементацию нейросети для фолдинга AlphaFold2 с использованием MMseqs2 (Many-against-Many sequence searching) с релаксацией наилучшей модели по Local Distance Difference Test score (pLDDT) из 5 предсказанных при помощи AMBER (Assisted Model Building with Energy Refinement). Из 5 предиктированных структур для транкрированной изоформы была выбрана структура с наивысшей суммарной pLDDT (per-residue estimate of confidence). Также была получена структура нетранкированной изоформы Т-кадгерина (NP_062681.2) с такими же параметрами, как и транкированная изоформа. Из 5 предиктированных структур для нетранкированной изоформы была выбрана структура с наивысшей суммарной pLDDT (per-residue estimate of confidence), необходимость в чем возникает в виду вышеописанной стохастической природы модели, и что означает, что полученная модель была наиболее приближенной к целевой. В нетранкированной форме присутствует ранее предсказанный при помощи InterPro прокадгериновый домен (выделен пунктиром), отсутствующий в транкированной. Прокадгериновый домен является вторым в структуре Т-кадгерина (относительно первой N-концевой альфа-спирали) и является внеклеточным доменом вместе с 5 кадгериновыми доменами, тогда как по результатам InterPro Phobius трансмембранный и внутриклеточный домены располагаются на противоположном С-конце Т-кадгерина. С помощью разработанного онлайн-сервиса pocketZebra были определены и получены данные о карманах на поверхности пространственной структуры Т-кадгерина. Суть алгоритма заключается в предварительном поиске гомологичных последовательностей, которые затем используются для определения консервативных участков, формирующих сайты связывания. Найденные карманы связывания располагаются в районах спиралей и содержат аминокислотные остатки, ответственные за связывание ионов кальция и взаимодействие с другими макромолекулами. Поскольку 3 домен располагается вне основной последовательности доменов Т-кадгерина и является гомологичным по последовательности остальным доменам, можно сделать вывод о том, что его отсутствие в транкированной форме может влиять н его функциональные свойства. При помощи веб-сервера Atomic Charge Calculator II подсчитали поверхностный заряд полученной структуры. Анализ поверхностных зарядов транкрированной изоформы показал сохранение природы зарядов в области кадгериновых доменов с их перераспределением в участке отсутствия 3 экзона, что позволяет предположить сохранение функционирования кадгериновых доменов. | ||
2 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Этап 2 |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | этап 3 |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".