Биоинформационные исследования новых механизмов регуляции процессов морфогенеза жировой ткани с участием Т-кадгеринаНИР

Bioinformatic search for novel T-cadherin-mediated regulatory mechanisms of morphogenesis in adipose tissue

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 мая 2023 г.-31 декабря 2023 г. этап 1
Результаты этапа: Разработаны новейшие биоинформатические методы и алгоритмы для анализа результатов клеточных и молекулярно-биологических исследований. Созданы биоинформатические базы данных с классификацией ключевых результатов на основе современных статистических методов. Разработаны и реализованы математические методы и инструменты анализа на основе современных вычислительных технологий, включая технологии Больших данных. Создана и фенотипически описана линия мышей Cdh13∆Exon3, у которых отсутствует экзон 3 в гене Cdh13. Молекулярно-биологическими и биохимическими методами исследован фенотип нокаутных мышей. Обнаружено, что общая морфология, продолжительность жизни и способность к размножению мышей Cdh13∆Exon3 находились в пределах нормы, в то время как масса тела была значительно ниже по сравнению с особями дикого типа (WT). Время бега и расстояние, пройденное мышами Cdh13∆Exon3 на беговой дорожке, было аналогично таковому у WT. Артериальное давление в состоянии покоя у мышей Cdh13∆Exon3 было несколько выше, чем у WT, однако при интенсивной физической нагрузке их систолическое артериальное давление было значительно выше. В то время как содержание адипонектина в миокарде мышей Cdh13∆Exon3 и WT было сопоставимым, уровень адипонектина в плазме был в 4,37 раза выше у мышей Cdh13∆Exon3. Помимо этого, интенсивные физические тренировки усиливали фосфорилирование AMPK в скелетных мышцах и миокарде мышей Cdh13∆Exon3 по сравнению с WT. Наши данные указывают на критически важную роль Т-кадгерина в регуляции артериального давления и выносливости у мышей, что может пролить свет на механизм патогенеза гипертонии. По результатам первой части работы по генотипированию опубликована работа в высокорейтинговом журнале. Полученные данные по иммуноцитохимическому окрашиванию клеток и жировой ткани полученной линии мышей указывают на присутствие в клетках Т-кадгерина, однако работы по сигнализации в присутствии лигандов Т-кадгерина выявили принципиальную разницу в кальциевом ответе клеток, что свидетельствует о нарушении функционального взаимодействия рецептор/лиганд в клетках полученной нокаутной линии. На следующем этапе планируется подробно исследовать особенности транкированной изоформы Т-кадгерина методом Вестерн блоттинга с различными антителами к Т-кадгерину и анализ цитоплазматической, мембранной и ядерной фракции на присутствие изоформ Т-кадгерина для ответа на вопрос о компартментализации и функциональных характеристиках исследуемого белка в клетках разных тканей мышей полученной линии. Известно, что нарушение экспрессии или функционирования Т-кадгерина, а также ряд описанных полиморфизмов человека в гене Т-кадгерина (CDH13) характерны для людей с метаболическими нарушениями, ожирением, диабетом 2 типа, что позволяет предположить важную роль Т-кадгерина в обменных процессах. Разработка моделей in vivo и in vitro с различными вариантами Т-кадгерина представляется перспективной для изучения фундаментальных механизмов возникновения метаболических нарушений и нарушений функционирования жировой ткани. Выполнено масс-спектрометрическое исследование образцов сердца и почки мышей линии Cdh13∆Exon3 и мышей дикого типа (WT). Используя метод ПААГЭ были выделены белки, которые по нашей гипотезе соответствуют различным изоформам Т-кадгерина. Метод трипсинолиза был использован для получения отдельных пептидов образцов Т-кадгерина для анализа методом времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией по методу МАЛДИ. В трипсинизированных образцах с использованием алгоритма Mascot нами были определены аминокислотные последовательности пептидов. Было выполнено выравнивание последовательностей идентифицированных пептидов на белковую последовательность Т-кадгерина, что позволило сделать вывод о наличии зрелых форм Т-кадгерина в образцах, полученных от животных WT. Обнаружено, что пептиды WT образцов покрывают только начальные участки белка. Выравнивание на ген Т-кадгерина позволило обнаружить, что WT образцы соответствуют зрелой форме и экспрессируют зрелую мРНК, которая содержит первый, второй, третий и десятый экзоны гена Т-кадгерина Выравнивание на ген Т-кадгерина пептидов полученных при процессинге нокаутных образцов (Cdh13∆Exon3) показало, что мРНК не переходит в зрелую форму поскольку третий экзон отсутствует, и пептидная последовательность покрывает исключительно первый и второй экзоны. Полученные экспериментальные результаты указывают на возможную экспрессию Т-кадгерина в нокаутных организмах Cdh13∆Exon3, однако идентификация пептидов затруднена в виду низкого содержания фрагментов данного белка и, по видимому, его активным протеолизом в протеасомах по причине неполной последовательности. Функциональные особенности изоформы Т-кадгерина изучены цитологическими методами: с целью выяснить, влияет ли модификация гена Т-кадгерина на его экспрессию и локализацию в различных клеточных компартментах проведен анализ локализации Т-кадгерина в различных субклеточных фракциях разного типа клеток, выделенных из мышей дикого типа (WT) и мышей линии Cdh13∆Exon3 методом вестерн блоттинга. В ходе выполнения работы нам удалось обнаружить изоформу Т-кадгерина с молекулярной массой около 80-85 кДа. Используя кальциевый сенсор - флуоресцентный зонд Fura-2 и прижизненную флуоресцентную микроскопию на одиночных клетках было продемонстрировано достоверное снижение амплитуды Са2+ответа при добавлении лиганда Т-кадгерина - ЛНП (70µg/ml) к фибробластам выделенным из тканей мышей линии Cdh13∆Exon3 по сравнению с клетками мышей дикого типа. Структурные механизмы взаимодействия Т-кадгерина с ЛНП и высокомолекулярным адипонектином на данный момент плохо изучены. Полученная линия мышей Cdh13∆Exon3, будет служить удобной моделью для изучения свойств Т-кадгерина и его изоформ in vivo, а также позволят провести аналогии с известными полиморфизмами Т-кадгерина у человека, что послужит основой для диагностики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и метаболических нарушений. Проанализирована способность МСК, выделенных из жировой ткани мышей линии Cdh13∆Exon3 к спонтанной адипогенной дифференцировке и адипогенной дифференцировке в условиях индукции коктейлем факторов (0.5 мM изобутиметилксантина, 1 μM дексаметазона, 5 μg/мл инсулина). Эффективность адипоцитарной дифференцировки оценивали по накоплению липидных капель в клетках с помощью гистологического окрашивания Oil Red O с последующей статистической обработкой полученных результатов. Обнаружено, что МСК, выделенные из подкожной жировой ткани мышей линии Cdh13∆Exon3 накапливают жировые капли при культивировании в плотном монослое, т.е. способны к спонтанной адипогенной дифференцировке. При использовании коктейля факторов, индуцирующих адипогенную дифференцировку, клеток с большими жировыми каплями становится значительно больше по сравнению с популяцией МСК, выделенных у животных дикого типа. Для проверки гипотезы о существовании петли регуляции по принципу отрицательной обратной связи способность МСК, выделенных из контрольных мышей и экспрессирующих транкированный Т-кадгерин, к адипогенной дифференцировке исследована в присутствии лигандов Т-кадгерина - ЛНП (70µg/ml) и HMW адипонектина (25µg/ml) в течение 5 дней. Проведенное исследование показало, что высокомолекулярный адипонектин не изменяет характер адипогенной дифференцировки МСК, выделенных из мышей линии Cdh13∆Exon3(Т-/-), по сравнению с такими же клетками, выделенными из контрольных мышей(с57) и экспрессирующими Т-кадгерин. В тоже время ЛНП подавляют адипогенную дифференцировку в контрольных клетках, что говорит об участии Т-кадгерина в адипогенезе. Любопытно, что в МСК, выделенных из мышей линии Cdh13∆Exon3(Т-/-) процент дифференцированных клеток также несколько снижен при действии LDL. Вероятно, структурные изменения Т-кадгерина у нокаутных животных все же позволяют функциональное взаимодействие Т-кадгерина с одним из лигандов. Проведен детальный биоинформационный анализ изоформы Т-кадгерина у мышей и поиск аналогичной изоформы у человека с акцентом на предсказание молекулярных, биохимических и физиологических особенностей такого варианта Т-кадгерина. В базах данных были найдены последовательности Т-кадгерина мыши и человека. После определения рамок считывания была смоделирована транкированная форма Т-кадгерина для человека. Поиск изоформы Т-кадгерина человека, ортологичной транкированной изоформе мыши проводили поиском нуклеотидной последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши и обнаружили, что последовательности, ортологичные последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши, у человека на всей своей длине полностью отсутствовала в 4 изоформе. Схожесть составила 68% для всей длины последовательностей и 95% для общего участка. Общий участок был получен как субвыравнивание из первоначального выравнивания MUSCLE транкированной изоформы мыши и 4 изоформы человека со стандартными параметрами. Для предсказания фолдинга транкированной изоформы Т-кадгерина мыши использовали ColabFold, имплементацию нейросети для фолдинга AlphaFold2 с использованием MMseqs2 (Many-against-Many sequence searching) с релаксацией наилучшей модели по Local Distance Difference Test score (pLDDT) из 5 предсказанных при помощи AMBER (Assisted Model Building with Energy Refinement). Из 5 предиктированных структур для транкрированной изоформы была выбрана структура с наивысшей суммарной pLDDT (per-residue estimate of confidence). Также была получена структура нетранкированной изоформы Т-кадгерина (NP_062681.2) с такими же параметрами, как и транкированная изоформа. Из 5 предиктированных структур для нетранкированной изоформы была выбрана структура с наивысшей суммарной pLDDT (per-residue estimate of confidence), необходимость в чем возникает в виду вышеописанной стохастической природы модели, и что означает, что полученная модель была наиболее приближенной к целевой. В нетранкированной форме присутствует ранее предсказанный при помощи InterPro прокадгериновый домен (выделен пунктиром), отсутствующий в транкированной. Прокадгериновый домен является вторым в структуре Т-кадгерина (относительно первой N-концевой альфа-спирали) и является внеклеточным доменом вместе с 5 кадгериновыми доменами, тогда как по результатам InterPro Phobius трансмембранный и внутриклеточный домены располагаются на противоположном С-конце Т-кадгерина. С помощью разработанного онлайн-сервиса pocketZebra были определены и получены данные о карманах на поверхности пространственной структуры Т-кадгерина. Суть алгоритма заключается в предварительном поиске гомологичных последовательностей, которые затем используются для определения консервативных участков, формирующих сайты связывания. Найденные карманы связывания располагаются в районах спиралей и содержат аминокислотные остатки, ответственные за связывание ионов кальция и взаимодействие с другими макромолекулами. Поскольку 3 домен располагается вне основной последовательности доменов Т-кадгерина и является гомологичным по последовательности остальным доменам, можно сделать вывод о том, что его отсутствие в транкированной форме может влиять н его функциональные свойства. При помощи веб-сервера Atomic Charge Calculator II подсчитали поверхностный заряд полученной структуры. Анализ поверхностных зарядов транкрированной изоформы показал сохранение природы зарядов в области кадгериновых доменов с их перераспределением в участке отсутствия 3 экзона, что позволяет предположить сохранение функционирования кадгериновых доменов.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Этап 2
Результаты этапа:
3 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. этап 3
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".