ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Будут синтезированы новые флуоресцентные зонды (на основе уже полученного нами митохондриально-направленного флуорофора BODIPY581/591-N2С12-ТРР, в котором флуоресцентная группа BODIPY581/591 соединена с проникающим в митохондрии катионом ТРР посредством N2С12 линкера, содержащего две пептидные связи) с избирательным сродством к кардиолипину для регистрации перекисного окисления липидов во внутренней мембране митохондрий в клеточных культурах. Cвойства этих зондов будут исследованы в модельных мембранных везикулах (липосомах), содержащих различные формы кардиолипина, что позволит оптимизировать структуру зондов и методики измерения уровня окисленности липидов. Испытания новых зондов будут проводиться на культурах клеток, где будет определена локализация зондов (колокализация с митохондриальными красителями) и их чувствительность к окислению кардиолипина и других липидов в митохондриях. С использованием полученных зондов, специфически реагирующих на окисление кардиолипина, будут проведены измерения уровня окисления липидов внутренней мембраны митохондрий при различных видах окислительного стресса. Будет исследована гетерогенность популяции митохондрий в одной клетке по уровню окисленности кардиолипина и других липидов, а также связь между степенью окисленности липидов и величиной митохондриального мембранного потенциала. С помощью новых митохондриально-направленных зондов и антиоксидантов будет выяснена возможная роль окисления липидов митохондрий в гибели клеток, а также роль митофагии в защите клеток от гибели при окислительном стрессе. С помощью новых митохондриально-направленных флуоресцентных зондов будет разработана методика оценки способности различных антиоксидантов (в первую очередь, митохондриально-направленных) защищать кардиолипин от окисления в культурах клеток. Полученные результаты будут использованы в разработке новых митохондриально-направленных антиоксидантов, дополняющих уже полученную в нашем институте линейку соединений семейства SkQ, одно из которых - SkQ1 - является первым в истории фармакологии официально одобренным и уже применяемым митохондриально-адресованным лекарственным препаратом.
New fluorescent probes with selective affinity to cardiolipin for registration of lipid peroxidation in mitochondrial inner membrane will be sdeveloped based on the already synthesized by us mitochondria-targeted fluorophore BODIPY581 / 591-N2C12-TPP in which a fluorescent group (BODIPY581 / 591) is connected to a penetrating cation TPP by a N2C12 linker containing two peptide bonds. Properties of the cardiolipin-specific probes will be investigated in model membrane vesicles (liposomes) containing various forms of cardiolipin. The structure of the probes and methods of measurement of lipid peroxidation will be optimized. Tests of the new probes in cell cultures will be performed to study the intracellular localization of the probes (co-localization with mitochondrial dyes) and their sensitivity to oxidation of cardiolipin and other lipids in mitochondria. Oxidation of lipids in the inner membrane of mitochondria will be measured those probes that showed the highest specificity to cardiolipin in response to different models of oxidative stress. We will study whether the heterogeneity of mitochondrial population correlates with the level of oxidation of cardiolipin and other lipids in the same cell, as well as possible correlation between the degree of lipids oxidation and magnitude of the mitochondrial membrane potential. The role of mitochondrial lipids oxidation in the cell cell death, as well as the possible protective action of mitophagy under oxidative stress will be studied using new mitochondria-targeted probes and antioxidants. A method for evaluating the ability of various antioxidants (first of all, the mitochondria-targeted antioxidants) to protect cardiolipin from oxidation in the cell cultures will be developed with the help of new mitochondria-targeted fluorescent probes. The results obtained will be used upon designing new mitochondria-targeted antioxidant to complement the family of the SkQ compounds already synthesized in our Institute. Оne of the antioxidants of the SkQ family - SkQ1 - is the first officially approved mitochondria-addressed drug in the history of pharmacology.
1 год: 1) Будут продолжены эксперименты с зондом BODIPY581/591-N2С12-ТРP и детально исследовано его окисление в липосомах, содержащих кардиолипин. В клеточных моделях будет исследовано окисление зонда при различных способах индукции окислительного стресса. 2) Будет создана молекулярно-динамическая модель поведения митохондриально направленных флуоресцентных зондов на основе флуорофора BODIPY (581/591) в мембране. С ее помощью будет проведен поиск структур наиболее перспективных митохондриально-направленных флуоресцентных зондов. 3) Будет начат синтез новых митохондриально-направленных флуоресцентных зондов на основе флуорофора BODIPY (581/591). 4) Планируется подобрать модель окислительного стресса, при котором наблюдался бы наиболее сильный ответ BODIPY581/591-N2С12-ТРР. Будет исследовано (i) действие умеренной гипоксии; (ii) мощный окислительный стресс, вызванный лишением сыворотки; (iii) вещества избирательно окисляющие глутатион или блокирующие его биосинтез; (iv) ингибиторы дыхательной цепи пьерицидин (комплекс I) и антимицин (комплекс III), которые могут индуцировать образование АФК в соответствующих сегментах дыхательной цепи; (v) редокс медиаторы паракват и менадион, которые восстанавливаются в митохондриях и образуют АФК, реагируя с кислородом. 5) Новые зонды будут тестироваться параллельно в липосомах и на культурах клеток.
Участники проекта более десяти лет участвуют в исследованиях клеточных сигнальных механизмов, которые связаны с окислительными процессами в митохондриях. При нашем участии разработаны и исследованы новые эффективные митохондриально-направленные антиоксиданты семейства SkQ на основе пластохинона, конъюгированного с такими проникающими катионами, как трифенилфосфоний (SkQ1, SkQ3 и др), родамин-19 (SkQR1), берберин (SkBerb) или пальмитин (SkQPalm) (1-8). Было проведено молекулярно-динамическое моделирование этих соединений в мембране и определены параметры их взаимодействия с кардиолипином (3). Митохондриально-направленные антиоксиданты гораздо эффективнее чем тролокс (водорастворимый антиоксидант на основе а-токоферола) защищали митохондриальные мембраны от ПОЛ вызванного гидроперекисью кумена. Было обнаружено, что фрагментация митохондрий и апоптоз, связанный с выходом цитохрома с в цитоплазму, зависят при окислительном стрессе от образования АФК в митохондриях и окисления кардиолипина. Также было показано, что митохондриальные АФК участвуют в передаче сигнала апоптоза между клетками (9). Обнаружено, что при деполяризации митохондрий может происходить их полная элиминация (митоптоз) (10). Установлено, что митохондриальные АФК играют важную роль в развитии воспаления и, в частности, в воспалительном ответе эндотелия. В экспериментах in vitro и in vivo показано выраженное противовоспалительное и ангиопротекторное действие митохондриально-направленных антиоксидантов (11). Кроме того, в процессе исследования дыхательных комплексов методами биоинформатики (12, 13) нами был предложен механизм, объясняющий высокую эффективность митохондриально-направленных антиоксидантов (12). Известно, что в физиологических условиях, для повышения эффективности окислительного фосфорелирования комплексы дыхательной цепи формируют суперкомплексы, богатые кардиолипином. Показано, что молекулы кардиолипина связывают между собой компоненты суперкомплексов.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Новые витальные флуоресцентные зонды для изучения перекисного окисления кардиолипина во внутренней мембране митохондрий: от модельных мембран до живых клеток |
Результаты этапа: Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном году 1. Отработан синтез флуоресцентного зонда, представляющего собой конъюгат катиона трифенилфосфония с флуоресцентной меткой BODIPY581/591 (BODIPY581-TPP), предназначенного для количественной и селективной оценки перекисного окисления кардиолипина во внутренней мембране митохондрий in vivo. Окисление диенового фрагмента этого зонда происходит при взаимодействии с перекисными липидными радикалами и сопряжено с повышением флуоресценции в красной области и с уменьшением флуоресценции в зеленой области. Наличие положительно заряженной группы и амидных групп в линкере обеспечивает сродство зонда к отрицительно заряженным группам на поверхности мембраны, в первую очередь к кардиолипиновыми доменами. 2. Методами молекулярного моделирования и квантово-химических расчетов было определено положение диена в молекуле BODIPY581-TPP относительно окисленного диена в жирнокислотных остатках кардиолипина. Сделан вывод, что способный окисляться остаток в молекуле BODIPY581-ТРР должен располагаться вблизи от перокси-групп жирных кислот кардиолипина. Молекулярно-динамическое моделирование указывает на то, что линкерная часть зонда BODIPY581-ТРР расположена вдоль мембраны, так что ее длина и состав мало влияют на глубину расположения диенового остатка, так что внесение модификаций в линкерную часть может повысить сродство зонда к кардиолипину, не изменив его чувствительности к окислению жирнокислотных остатков. Молекулярно-динамическое моделирование указывает на высокую эффективность и селективность нового зонда BODIPY581-ТРР по отношению к окисленной форме кардиолипина. 3. Исследовано влияние низкомолекулярных миметиков BODIPY581-TPP на окисление кардилипиновых липосом, которое запускалось двумя разными методами. В первом случае для инициации цепной перекисной реакции использовали гидрофобный азоинициатор 2,2′-азобис-(4-метокси-2,4-диметилвалеронитрил) (MeO-AMVN). При этом оценивалась способность миметиков тушить пероксильные радикалы. Во втором случае для инициации цепной перекисной реакции использовали цитохром c, который при взаимодействии с липидными перекисями, всегда присутствующими в мембране, способен превращаться в пероксидазу (рис. 7) и окислять молекулы кардиолипина. Этом случае исследовалась еще и способность миметиков связыватся с кардиолипином и препятствовать его взаимодействию с цитохромом с. В качестве миметиков использовались креатин, карнозин и L-карнитин, низкомолекулярные соединения, присутствующие в клетках в больших количествах. Креатин и карнозин имеют амидо- и аминогруппы, а L-карнитин имеет положиельно заряженную холиновую группу и обладает способностью связываться с жирными кислотами. Исследование этих соединений представляло интерес не только с методической точки зрения, но и одновременно позволяло прояснить антиокислительные свойства этих соединений, функция которых в клетке остается неясной уже около ста лет. Нельзя было исключить, что многочисленные сообщения о способности этих соединений предотвращать апоптоз могут отражать их способность связываться с кардиолипином и препятствовать его окислению цитохромом с. Ни одно из испытанных соединений не оказалось истинным антиоксидантом по отношению к кардиолипину. Карнозин, однако, обладал слабым прооксидантным действием. Испытанные соединения в высокой концентрации 1 мМ не оказывали влияния на индуцированное цитохромом c окисление кардиолипина, что говорит об их неспособности препятствовать взаимодействию кардиолинина с цитохромом с. 4. Исследовалась способность BODIPY581-TPP отслеживать окисление липидов в клетках в разных моделях окислительного стресса. BODIPY581-TPP оказался способен детектировать митохондриальный стресс В клетках, обработанных перекисью водорода или гидроперекисью кумола, добавление митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1, способного уже в концентрации 20 нМ эффективно предотвращать окислительный стресс, предотвращало и ответ BODIPY581-TPP во всех вариантах индукции. Для индукции митохондриального окислительного стресса были также использованы ингибиторы дыхательной цепи пьерицидин и антимицин, а также редокс медиаторы менадион и бриллиантовый зеленый, которые восстанавливаются в митохондриях и образуют АФК, реагируя с кислородом. Было показано, что редокс медиаторы вызывали значительную дозо-зависимую генерациию АФК, тогда как ингибиторы дыхания не вызывали существенного окислительного стресса. Соответственно, и флуоресценция BODIPY581-TPP не менялась существенно в ответ на добавление ингибиторов, но заметно менялась в присуствии медиаторов. 5. BODIPY581-TPP был также применен для исследования особенностей развития окислительного стресса при наследственной оптической нейропатии Лебера (LHON). Было показано, что BODIPY581-TPP отслеживал как окисление липидов, так и его предотвращение антиоксидантами. Таким образом, нами было показана возможность применения BODIPY581-TPP для изучения окислительного повреждения митохондриальной мембраны в ответ на окислительный стресс различной природы и на различных объектах. Поскольку ранее было показано, что в ответ на окислительный стресс окисляется почти исключительно кардиолипин, использовавшийся нами флуоресцентый зонд BODIPY581-TPP сообщал именно о его окислении, что говорит о сродстве нового зонда к кардиолипину. 6. Разаработана модель, в соответствии с которой конечная судьба клетки определяется балансом между запускающимися в ответ на окисление кардиолипина проапоптотическими и антиапоптотическими реакциями. Идентифицирована цепь антиапоптозных реакций. Благодаря наличию двух противоположно направленных регуляторных путей, митохондриально направленные антиоксиданты, уменьшая количество окисляющегося кардиолипина, могут смещать баланс в сторону выживания как клеток, так и организмов в случае многих патологий. По материалам проведенного исследования подготовлена статья, принятая к печати (Armen Y. Mulkidjanian, Daria N. Shalaeva, Konstantin G. Lyamzaev, Boris V. Chernyak, "Could fragmentation of mitochondria in response to oxidative stress prevent apoptosis?"). | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Новые витальные флуоресцентные зонды для изучения перекисного окисления кардиолипина во внутренней мембране митохондрий: от модельных мембран до живых клеток |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Новые витальные флуоресцентные зонды для изучения перекисного окисления кардиолипина во внутренней мембране митохондрий: от модельных мембран до живых клеток |
Результаты этапа: В рамках проекта в течение 2017-2019 гг нами были впервые разработаны, синтезированы и изучены новые митохондриально-направленные флуоресцентных зонды для регистрации окисления кардиолипина in vivo, в митохондриях живых клеток. Первым был изучен зонд MitoCLox, было показано, что этот зонд селективно накапливается в митохондриях и служит чрезвычайно удобным индикатором окисления митохондриальных липидов. Мы использовали MitoCLox как платформу для получения новых зондов с еще большей избирательностью по отношению к кардиолипину. Один из возможных подходов, основанный на увеличении положительного заряда зонда, был испытан при создании зонда, несущего остаток аргинина в составе линкера (MitoCLox-Arg). Эксперименты на липосомах позволили измерить количественные различия в сродстве синтезированных нами флуоресцентных зондов к кардиолипину и к нейтральным фосфолипидам. Проведенные измерения показали, что как MitoCLox, так и MitoCLox-Arg значительно лучше связываются с кардиолипиновыми липосомами, чем с липосомами из нейтрального фосфолипида. Разница в сродстве оказалась выше в случае MitoCLox-Arg, который оказался специфичным по кардиолипину и очень плохо связывался с нейтральными липидами, такими как фосфатидилхолин. Эксперименты с изолированными митохондриями показали, что MitoCLox-Arg обладает высокой чувствительностью к окислению липидов, которая мало отличалась от чувствительности MitoCLox. Эксперименты с клетками, однако, показали, что введение дополнительного заряда в молекулу MitoCLox-Arg несколько снизило способность зонда проникать через внешнюю мембрану клетки, так что часть зонда попадала в клетку путем эндоцитоза. Дальнейшее использование MitoCLox-Arg возможно с использованием липофильных анионных соединений, которые могут способствовать его проникновению через мембрану и предотвращать эндоцитоз. Экранирование остатка аргинина ароматическими остатками в составе линкера так же может повысить способность молекулы зонда проникать через мембрану. В настоящее время разрабатывается схема синтеза подобной молекулы. С помощью MitoCLox мы исследовали роль перекисного окисления митохондриальных липидов в падении мембранного потенциала при окислительном стрессе. Было показано, что окисление MitoCLox начинается сразу после индукции окислительного стресса перекисью водорода, а снижение мембранного потенциала происходит лишь через 40 минут после добавки перекиси водорода. Можно предполагать, что мембранный потенциал может поддерживаться столь продолжительное время за счет гидролиза запасов внутриклеточного АТФ, образуемого за счет гликолиза, с помощью АТФ-синтазы, что может компенсировать утечку протонов через частично окисленную мембрану. Интересно, что массовая фрагментация митохондрий наблюдалась лишь при падении мембранного потенциала, т.е. начиналась одновременно с достижением высокой степени окисленности митохондриальной мембраны. С помощью MitoCLox была исследована гетерогенность популяции митохондрий в составе одной клетки. В эндотелиальных клетках была выявлена фракция митохондрий с повышенным уровнем окисленности фосфолипидов. Эти митохондрии были небольшими, округлыми и располагались вблизи ядра. Эти же митохондрии имели пониженный уровень мембранного потенциала. Можно полагать, что перекисное окисление липидов митохондрий (прежде всего кардиолипина) может быть причиной снижения мембранного потенциала в части митохондриальной популяции. Возможно, эти митохондрии служат своеобразными датчиками клеточного окислительного стресса, и при превышении допустимого предела быстро запускать механизм клеточной гибели. Мы показали, что эти митохондрии могут служить мишенью для избирательной аутофагии (митофагии). Элиминация этих митохондрий может служить одной из причин защитного действия аутофагии при различных стрессах. | ||
4 | 1 мая 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Новые витальные флуоресцентные зонды для изучения перекисного окисления кардиолипина во внутренней мембране митохондрий: от модельных мембран до живых клеток |
Результаты этапа: | ||
5 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Новые витальные флуоресцентные зонды для изучения перекисного окисления кардиолипина во внутренней мембране митохондрий: от модельных мембран до живых клеток |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".