![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Настоящий проект фокусируется на одной из серьезнейших проблем современной биоаналитической химии, а именно на разработке высокочувствительных методов определения пищевых аналитов. Для этого планируется разработать метод синтеза нового ковалентного антитело-пероксидазного конъюгата с повышенным соотношением фермент/антитело. Синтез конъюгата будет осуществляться за счет ковалентной иммобилизации специфических антител и пероксидазы хрена на поверхности наночастиц золота, при этом будет найден оптимальный размер наночастиц для получения наиболее активного конъюгата. Свойства полученного конъюгата будут всесторонне исследованы. Планируется продемонстрировать преимущества нового конъюгата в иммуноферментном анализе (ИФА) бета-агонистов (рактопамина, кленбутерола и сальбутамола), при этом будут разработаны как плашечные тест-системы, так и иммунохроматографические полоски. Дополнительно для повышения чувствительности ИФА будет использован хемилюминесцентный метод определения пероксидазы с применением фенотиазиновых усилителей. Практическая значимость разработанных ИФА будет продемонстрирована при определении бета-агонистов в образцах говядины и свинины.
This project focuses on one of the most serious problems of modern bioanalytical chemistry, namely the development of highly sensitive methods for determining food analytes. For this purpose, it is planned to develop a method for the synthesis of a new covalent antibody-peroxidase conjugate with an increased ratio enzyme/antibody. Synthesis of the conjugate will be carried out by covalent immobilization of specific antibodies and horseradish peroxidase on the surface of gold nanoparticles, and the optimal size of nanoparticles will be found to obtain the most active conjugate. The properties of the conjugate will be investigated. It is planned to demonstrate the advantages of the new conjugate in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of beta-agonists (ractopamine, clenbuterol and salbutamol), and both test test systems and immunochromatographic strips will be developed. In addition, to increase the sensitivity of ELISA, a chemiluminescent method for determining peroxidase using phenothiazine enhancers will be used. The practical importance of the developed ELISA will be demonstrated at determining of beta-agonists in beef and pork samples.
1. Будут синтезированы конъюгаты бета-агонистов с инертными белками и пероксидазой хрена (ПХ) 2. Будет получены и выделены моноклональные антитела против рактопамина, кленбутерола и сальбутамола 3. Будут получены наночастицы золота с различным диаметром 4. Будут получены препараты антител против рактопамина, кленбутерола и сальбутамола, содержащие свободные SH-группы 5. Будет получен препарат пероксидазы хрена, содержащей свободные SH-группы 6. Будет разработан метод синтеза тройного ковалентного конъюгата (Au-ПХ-антитело) 5. Будет определено содержания компонентов тройного ковалентного конъюгата 7. Будет разработан хемилюминесцентный конкурентный иммуноферментный анализ рактопамина, кленбутерола и сальбутамола с использованием тройных ковалентных конъюгатов, проведено сравнение методов, которые будут разработаны, с ИФА с традиционным конъюгатом (ПХ-антитело) 8. Будет проведено тестирование хемилюминесцентного иммуноферментного анализа рактопамина, кленбутерола и сальбутамола с использованием тройного ковалентного конъюгата в анализе реальных образцов (говядины и свинины) 9. Будут сконструированы иммунохроматографические тест-полоски для определения рактопамина, кленбутерола и сальбутамола с использованием тройных ковалентных конъюгатов, проведено сравнение полосок, которые будут разработаны, с иммунохроматографическими тест-полосками с применением традиционного конъюгата 10. Будет проведено тестирование иммунохроматографических тест-полосок для определения рактопамина, кленбутерола и сальбутамола с использованием тройного ковалентного конъюгата в анализе реальных образцов (говядины и свинины)
Приоритет использования тройного ковалентного конъюгата наночастиц золота с иммобилизованными антителами и пероксидазой хрена в иммуноферментном анализе принадлежит российской стороне. Недавно участниками российской команды была продемонстрирована возможность получения такого ковалентного тройного комплекса с сохранением активности антител и пероксидазы. В полученном конъюгате соотношение активных молекул фермента и антител было равно 13, что значительно выше, чем в традиционно используемых пероксидаза-антительных конъюгатах (1:1 или 2:1). Данные предварительные результаты показали перспективность развития данного подхода для повышения чувствительности иммуноферментного анализа. Более того, в проекте планируется разработка методов анализа бета-агонистов с применением хемилюминесцентной детекцией. Данный метод планомерно и эффективно развивается российской командой на протяжении последних лет. Так, нами были обнаружены новые на сегодняшний день самые эффективные фенотиазиновые усилители хемилюминесценции, катализируемой пероксидазами растений. Таким образом, сочетание двух оригинальных подходов, перечисленных выше, приведет к созданию оригинальных методов анализа бета-агонистов.
Chung Shan Medical University | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 17 марта 2017 г.-3 марта 2018 г. | «Разработка чувствительных иммуноферментных методов определения бета-агонистов с применением тройного ковалентного конъюгата наночастиц золота с антителами и пероксидазой хрена с повышенным соотношением фермент/антитело |
Результаты этапа: Настоящий проект фокусируется на разработке метода синтеза нового ковалентного антитело-пероксидазного конъюгата с повышенным соотношением фермент/антитело. В течение 2017 года проведены исследования по модификации пероксидазы хрена и различных антител N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликоливой кислоты для введения в структуру белков свободных сульфгидрильных групп. С использованием синтезированных наночастиц золота различного размера получены тройные конъюгаты нааночастиц золота с ковалентно иммобилизованными антителами (против IgG кролика и цитринина) и пероксидазы. Условия синтеза были оптимизированы при варьировании размера используемых наночастиц, степени модификации антител и молярного соотношения пероксидазы и антител в реакционной смеси. Для обоих типов антител получены активные тройные конъюгаты, что позволило успешно применить их в иммуноферментном анализе. Дополнительно для повышения чувствительности методом анализа был использован хемилюминесцентный метод определения пероксидазы с применением фенотиазиновых усилителей. Практическая значимость разработанного метода анализа для определении цитринина была продемонстрирована в образцах красного риса. | ||
2 | 3 марта 2018 г.-18 марта 2019 г. | «Разработка хемилюминесцентных иммуноферментных методов определения бета-агонистов с применением тройного конъюгата |
Результаты этапа: В течение 2018 г. были разработаны два формата ИФА для определения салбутамола (САМ), а именно прямой и непрямой конкурентные ИФА. Следует отметить, что непрямой конкурентный ИФА был разработан в сочетании с колориметрической и хемилюминесцентной детекцией, причем последний вариант анализа оказался значительно более чувствительным. В то же время, хотя была проведена большая экспериментальная работа, получить активные тройные конъюгаты (антитела против САМ-золотые наночастицы-ПХ) не удалось. При выяснении причин этого было показано, что в отличие от других антител, используемые нами антитела против САМ инактивируются под действием N-гидроксисукцинимидного эфира S-ацетилтиогликоливой кислоты (ГЭАТ), реагента, используемого для введения сульфгидрильных групп в молекулы антител. Работы по синтезу активных тройных конъюгатов следует продолжить. | ||
3 | 23 июля 2019 г.-20 июня 2020 г. | «Разработка хемилюминесцентных иммуноферментных методов определения бета-агонистов с применением тройного конъюгата |
Результаты этапа: В течение срока выполнения проекта были разработаны прямой и непрямой конкурентные ИФА для определения салбутамола (SAL), используя ковалентные конъюгаты пероксидаза(HRP)-антитело. Специфические антитела против SAL (SAL-Ab), использованные в ИФА, были получены при иммунизации кроликов. Для повышения активности конъюгата предложено увеличить соотношение фермент:антитело в составе конъюгата. В процессе выполнения проекта разрабатывались методики синтеза активного тройного конъюгата следующего состава: SAL-Ab—золотые наночастицы(GNPs)—HRP. Одна из схем синтеза получения SAL-Ab—GNPs—HRP предполагала проведение ковалентной соиммобилизации SAL-Ab и HRP с сульфгидрильными группами, предварительно введенными в их структуру, на поверхности GNPs. Введение сульфгидрильных групп осуществлялось модификацией исследуемых белков N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликоливой кислоты (SATA). В другом варианте на GNPs ковалентно иммобилизовалась HRP с последующей сорбцией SAL-Ab на HRP—GNPs. Тройные конъюгаты по обеим схемам были получены, однако такие конъюгаты были неактивны в ИФА. При выяснении причин этого экспериментального факта было показано, что в отличие от других антител, используемые SAL-Ab имеют низкую стабильность и инактивируются под действием как SATA, так и в результате сорбции на GNPs. В отличие от SAL-Ab, HRP не теряла свою активность при синтезе тройных конъюгатов. Более того, синтезированные тройные конъюгаты демонстрировали высокую пероксидазную активность. Для повышения стабильности SAL-Ab были конъюгированы с HRP. Повышение стабильности SAL-Ab происходило, по-видимому, за счет формирования межмолекулярных ковалентных и нековалентных связей. В последствие такие стабилизированные конъюгаты были сорбированы на GNPs, что позволило получить активный тройной конъюгат. Предел обнаружения, IC50 и линейный диапазон для прямого конкурентного ИФА с применением тройного конъюгата составили 0.003, 2.95 и 0.03 – 208 нг/мл соответственно. Экспериментальная работа по дальнейшему повышению эффективности тройного конъюгата за счет сорбции конъюгата SAL-Ab—HRP на GNPs с иммобилизованной HRP из-за пандемии коронавируса не проведена, но будет обязательно сделала сразу же, как только откроются двери лаборатории. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".