«Разработка чувствительных иммуноферментных методов определения бета-агонистов с применением тройного ковалентного конъюгата наночастиц золота с антителами и пероксидазой хрена с повышенным соотношением фермент/антителоНИР

Development of ultra-sensitive enzyme immunochemical assays of B-agonists using ternary covalent conjugate of gold nanoparticles with antibody and horseradish peroxidase with an improved ratio enzyme/antibody

Соисполнители НИР

Chung Shan Medical University Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 17 марта 2017 г.-3 марта 2018 г. «Разработка чувствительных иммуноферментных методов определения бета-агонистов с применением тройного ковалентного конъюгата наночастиц золота с антителами и пероксидазой хрена с повышенным соотношением фермент/антитело
Результаты этапа: Настоящий проект фокусируется на разработке метода синтеза нового ковалентного антитело-пероксидазного конъюгата с повышенным соотношением фермент/антитело. В течение 2017 года проведены исследования по модификации пероксидазы хрена и различных антител N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликоливой кислоты для введения в структуру белков свободных сульфгидрильных групп. С использованием синтезированных наночастиц золота различного размера получены тройные конъюгаты нааночастиц золота с ковалентно иммобилизованными антителами (против IgG кролика и цитринина) и пероксидазы. Условия синтеза были оптимизированы при варьировании размера используемых наночастиц, степени модификации антител и молярного соотношения пероксидазы и антител в реакционной смеси. Для обоих типов антител получены активные тройные конъюгаты, что позволило успешно применить их в иммуноферментном анализе. Дополнительно для повышения чувствительности методом анализа был использован хемилюминесцентный метод определения пероксидазы с применением фенотиазиновых усилителей. Практическая значимость разработанного метода анализа для определении цитринина была продемонстрирована в образцах красного риса.
2 3 марта 2018 г.-18 марта 2019 г. «Разработка хемилюминесцентных иммуноферментных методов определения бета-агонистов с применением тройного конъюгата
Результаты этапа: В течение 2018 г. были разработаны два формата ИФА для определения салбутамола (САМ), а именно прямой и непрямой конкурентные ИФА. Следует отметить, что непрямой конкурентный ИФА был разработан в сочетании с колориметрической и хемилюминесцентной детекцией, причем последний вариант анализа оказался значительно более чувствительным. В то же время, хотя была проведена большая экспериментальная работа, получить активные тройные конъюгаты (антитела против САМ-золотые наночастицы-ПХ) не удалось. При выяснении причин этого было показано, что в отличие от других антител, используемые нами антитела против САМ инактивируются под действием N-гидроксисукцинимидного эфира S-ацетилтиогликоливой кислоты (ГЭАТ), реагента, используемого для введения сульфгидрильных групп в молекулы антител. Работы по синтезу активных тройных конъюгатов следует продолжить.
3 23 июля 2019 г.-20 июня 2020 г. «Разработка хемилюминесцентных иммуноферментных методов определения бета-агонистов с применением тройного конъюгата
Результаты этапа: В течение срока выполнения проекта были разработаны прямой и непрямой конкурентные ИФА для определения салбутамола (SAL), используя ковалентные конъюгаты пероксидаза(HRP)-антитело. Специфические антитела против SAL (SAL-Ab), использованные в ИФА, были получены при иммунизации кроликов. Для повышения активности конъюгата предложено увеличить соотношение фермент:антитело в составе конъюгата. В процессе выполнения проекта разрабатывались методики синтеза активного тройного конъюгата следующего состава: SAL-Ab—золотые наночастицы(GNPs)—HRP. Одна из схем синтеза получения SAL-Ab—GNPs—HRP предполагала проведение ковалентной соиммобилизации SAL-Ab и HRP с сульфгидрильными группами, предварительно введенными в их структуру, на поверхности GNPs. Введение сульфгидрильных групп осуществлялось модификацией исследуемых белков N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликоливой кислоты (SATA). В другом варианте на GNPs ковалентно иммобилизовалась HRP с последующей сорбцией SAL-Ab на HRP—GNPs. Тройные конъюгаты по обеим схемам были получены, однако такие конъюгаты были неактивны в ИФА. При выяснении причин этого экспериментального факта было показано, что в отличие от других антител, используемые SAL-Ab имеют низкую стабильность и инактивируются под действием как SATA, так и в результате сорбции на GNPs. В отличие от SAL-Ab, HRP не теряла свою активность при синтезе тройных конъюгатов. Более того, синтезированные тройные конъюгаты демонстрировали высокую пероксидазную активность. Для повышения стабильности SAL-Ab были конъюгированы с HRP. Повышение стабильности SAL-Ab происходило, по-видимому, за счет формирования межмолекулярных ковалентных и нековалентных связей. В последствие такие стабилизированные конъюгаты были сорбированы на GNPs, что позволило получить активный тройной конъюгат. Предел обнаружения, IC50 и линейный диапазон для прямого конкурентного ИФА с применением тройного конъюгата составили 0.003, 2.95 и 0.03 – 208 нг/мл соответственно. Экспериментальная работа по дальнейшему повышению эффективности тройного конъюгата за счет сорбции конъюгата SAL-Ab—HRP на GNPs с иммобилизованной HRP из-за пандемии коронавируса не проведена, но будет обязательно сделала сразу же, как только откроются двери лаборатории.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".