ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Протеасома играет ключевую роль в регуляции уровня специфических белков, таким образом поддерживая гомеостаз внутри клеток млекопитающих. Протеасома катализирует деградацию белков, участвующих в управлении жизненным циклом клеток, регулируя их внутриклеточные концентрации, а также избирательно уничтожает потенциально вредоносные аномальные или денатурированных белки, которые могут вырабатываться при различных патологических процессах. Еще одной важной функцией протеасомы является участие в процессах, связанных с работой иммунной системы, то есть в деградации белков с образованием антигенных пептидов, которые затем презентируются на молекулах главного комплекса гистосовместимости. Протеасома – высокомолекулярный белковый комплекс, обладающий протеолитической активностью с широкой субстратной специфичностью. Один из активных центров протеасомы катализирует протеолиз со специфичностью по типу трипсина, другой с химотрипсиноподобной специфичностью, а третий с каспазоподобной. Самой важной для протеолиза считается химотрипсиноподобная активность. В организме животных, имеющих иммунную систему, содержится два типа протеасомы – стандартная протеасома и иммунопротеасома. Под действием провоспалительных цитокинов в клетках начинается биосинтез каталитических иммуносубъединиц. Они гомологичны конститутивным субъединицам, но обладают другой субстратной специфичностью, и благодаря усиленной экспрессии встраиваются во вновь собирающиеся частицы протеасомы, вместо конститутивных субъединиц. Целью проекта является исследование процесса протеолиза основного белка миелина (ОБМ) 20S, 26S конститутивными и 26S иммунопротеасомой, выделенными из здоровых мышей и мышей, развивающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит - модель рассеянного склероза. Рассеянный склероз, хроническое нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы, характеризуется разрушением миелиновой оболочки, что, в свою очередь, приводит к деградации нервных волокон. Среди аутоантител, обнаруживаемых в сыворотках крови и цереброспинальной жидкости больных, страдающих этой патологией, особое место занимают иммуноглобулины к основному белку миелина (ОБМ) и фрагментам его деградации. Детали процесса, при котором происходит генерация фрагментов ОБМ, обладающих антигенными свойствами, до конца не ясны. Некоторые исследователи склонны приписывать процессу “вырезания” пептидных эпитопов ОБМ роль пускового механизма, индуцирующего нейродегенеративный процесс. Ранее было показано, что в деградации ОБМ могут принимать участие каталитические антитела и некоторые протеазы, ассоциированные с рассеянным склерозом. Стоит отметить, что в любой эукариотической клетке существует также специализированная органелла для направленной деградации белков – протеасома. Одной из функций протеасом является генерация пептидов, которые затем экспонируются на клеточной мембране с помощью молекул комплексов гистосовместимости. Есть все основания полагать, что протеасома принимает непосредственное участие в процессе специфической деградации ОБМ. Детали этого механизма до настоящего момента остаются невыясненными. Поэтому крайне важно изучить роль процессинга основного белка миелина для более полного понимания индукции и развития патологического процесса демиелинизации оболочки нервных клеток.
Была отработана и улучшена методика выделения 20S и 26S протеасомы из различных источников (клетки линий CHO, NS0, HeLa, печень и мозг мышей линий Balb/c и SJL). Очищенные препараты протеасомы охарактеризованы методом электрофореза в ПААГ и иммуноблоттингом. Методом иммуноблоттинга выявлено высокое количество иммуносубъединицы LMP2 в головном мозге мышей линии SJL, развивающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), заболевание, аналогичное рассеянному склерозу. Были изучены составы протеасом клеток линий CHO, NS0 и HeLa, в зависимости от обработки гамма-интерфероном. Показано, что под действием гамма-интерферона в клетках СНО нарабатывается LMP2-иммуносубъединица, в клетках NS0 LMP7-иммуносубъединица, а в клетках HeLa – обе эти иммуносубъединицы. Получены кинетические характеристики протеасомы по флуорогенным субстратам для определения химотрипсиноподобной, трипсиноподобной и каспазоподобной активности. Для протеасом, выделенных из различных источников, в том числе из мозга мышей, получены характеристики гидролиза люминесцентного субстрата для определения химотрипсиноподобной активности. Проверены еще 22 пептидных производных, содержащие флуорогенные и хромогенные группы в качестве субстратов протеасомы с внутренним тушением флуоресценции. Был сделан вывод, что флуорогенные субстраты можно использовать для рутинного контроля активности протеасомы, например, в процессе выделения и очистки, в то время как люминесцентные субстраты можно использовать для внутриклеточного определения активности протеасомы. Синтезированы два специфических ингибитора иммуносубъединиц: субъединицы LMP2 (UK101) и субъединицы LMP7 (PR-957) – пептидомиметики, содержащие эпоксикетонную группу. Исследована кинетика ингибирования препаратов протеасомы семью ингибиторами: бортезомибом, MG132, MG132-эпоксикетоном, лактацистином, UK101, PR-957 и эпоксомицином и получены значения IC50. Показано, что бортезомиб является сильным, но не селективным ингибитором, в то время как ингибитор субъединицы LMP2 действительно селективен, и значения IC50 для протеасом из мозга мышей линии BALB/c и из мозга мышей линии SJL по этому ингибитору различаются практически на три порядка. С использованием люминесцентного субстрата удалось рассчитать константы ингибирования протеасомы бортезомибом, MG-132 и специфическим ингибитором субъединицы LMP2. Определена максимальная степень ингибирования химотрипсиноподобной активности очищенной протеасомы этими тремя ингибиторами. Выделенные препараты протеасомы были использованы для протеолиза основного белка миелина (ОБМ). Гидролизаты ОБМ проанализированы методами MALDI и LC-MS масс-спектрометрии. Обнаружено, что пептиды, получающиеся при протеолизе ОБМ препаратами 26S протеасомы из разных источников, значительно отличаются. В составе ОБМ выделяют так называемый энцефалитогенный фрагмент (82-98), который, как было показано ранее, стимулирует развитие рассеянного склероза. В гидролизате ОБМ 26S протеасомой, выделенной из печени аутбредных мышей, этого фрагмента не обнаружено. В гидролизате ОБМ протеасомой, выделенной из мозга здоровых мышей линии SJL, было обнаружено значительное количество фрагмента 82-89 (до 25% от всех найденных пептидов). В гидролизате ОБМ протеасомой, выделенной из мозга мышей линии SJL, развивающих ЭАЭ, количество этого фрагмента достигает уже 50% от всех найденных пептидов. Данные подтвержденные с помощью оригинальной методики количественной МАЛДИ масс-спектрометрии. Также был изучен протеолиз ОБМ коммерческими препаратами протеиназ, ассоциированных с рассеянным склерозом. Гидролизаты проанализированы методом MALDI. Определены сайты протеолиза ОБМ разными ферментами. Обнаружено, что число, а также длина пептидов, получающихся при протеолизе ОБМ препаратами протеасомы из разных источников, и протеазами, значительно отличаются. Показано, что гидролизаты основного белка миелина, полученные при расщеплении ОБМ протеасомой из мозга мышей, обладают некоторым цитотоксическим действием. Опробованы несколько способов доставки и изучено действие малых интерферирующих РНК на биосинтез различных субъединиц протеасомы в клеточных линиях NSO. Были начаты работы по локализации субъединиц протеасомы в различных типах клеток, включая клетки головного мозга. В результате проделанной работы удалось подобрать условия окраски клеток линии HeLa и астроцитов. Кроме того, удалось получить первичную культуру клеток мозга семидневных мышат, обработанную факторами, стимулирующими созревание олигодендроцитов. Таким образом, можно сделать вывод, что под действием гамма-интерферона экспрессирующиеся иммуносубъединицы протеасомы изменяют паттерн деградации ОБМ таким образом, что нарабатывается большое количество пептида, который может презентироваться на главном комплексе гистосовместимости и активировать CD8+ Т-лимфоциты. Следовательно, существует вероятность того, что протеасома играет одну из ключевых ролей в развитии ЭАЭ, а возможно, и рассеянного склероза.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. | Процессинг протеасомой основного белка миелина при аутоиммунных патологиях |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. | Процессинг протеасомой основного белка миелина при аутоиммунных патологиях |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. | Процессинг протеасомой основного белка миелина при аутоиммунных патологиях |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".