ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
B-клетки играют важную роль в развитии и патогенезе как системных, так и орган-специфических аутоиммунных заболеваний. Аутореактивные B-клетки не только продуцируют аутоантитела, но также способны эффективно представлять специфические аутоантигены Т-клеткам. Кроме того, В-клетки могут секретировать провоспалительные цитокины и усиливать патологические процессы саморазрушения. Терапия, при которой происходит селективная элиминация патогенных аутореактивных В-клеток, потенциально может стать универсальным подходом для лечения многих аутоиммунных заболеваний. Стоит отметить, что существующая на сегодняшний день терапия аутоиммунных заболеваний путем практически полного элиминирования В-клеток моноклональным анти-CD20/19 антителом Ритуксимаб (Rituximab), приводит к системным побочным явлениям, и явно требует значительного пересмотра. В данном исследовании будет создан репертуар генетически сконструированных молекул-киллеров В-клеток, которые специфически действуют только на один тип В-лимфоцитов, несущий соответствующий В-клеточный рецептор. Будут сконструированы иммунотоксины, слитые с В-клеточными эпитопами основного белка миелина (ОБМ), и основанные на константном домене антитела IgG.
На первом этапе выполнения проекта у трех групп животных: мышей линии SJL/J, C57/BL6, и крыс линии DA удалось развить экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE). У животных произведен отбор крови, сыворотки крови проанализированы на наличие антител к основному белку миелина (МВР), и определен уровень иммуноглобулинов к МВР. Подтверждена прямая корреляция между степенью проявления симптомов ЕАЕ и титра аутоантител к МВР. Показано, что уровень иммуноглобулинов к основному белку миелина в сыворотке крови мышей линии SJL/J с индуцированным EAE значительно выше, чем у мышей линии C57/BL6 с EAE и крыс линии DA c ЕАЕ. В контрольных сыворотках иммуноглобулинов к МВР не обнаруживается. Исследована специфичность аутоантител с помощью сконструированной функциональной «эпитопной библиотеки», соответствующей полноразмерному MBP и представляющей собой 12 перекрывающихся пептидов в составе слитных белков с тиоредоксином. Определены фрагменты МВР – потенциальные эпитопы аутореактивных В-клеток по связывающей активности поликлонального пула иммуноглобулинов из сыворотки крови мышей линии SJL, развивающих EAE. Уровни аутоантител к фрагментам MBP 25-54 (3), MBP 65-132 (6-8) и 145-170 (12) в сравнении с контрольным белком-носителем были достоверно выше в сыворотке крови мышей EAE SJL. Предполагается, что основной сайт связывания сывороточных антител мышей с индуцированным ЕАЕ целиком включает в себя последовательность пептида 7 (TQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPS), а также C-концевую последовательность пептида 6 (QDENPVVHFFK) и N-концевую последовательность пептида 8 (FKNIVTPRTPPPSQG). Для дальнейших исследований выбраны следующие фрагменты ОБМ: пептиды 3, 7, 11, 12 и их укороченные варианты, и на их основе созданы генетические конструкции, кодирующие эти фрагменты, слитные с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов мыши. Плазмидные ДНК, содержащие корректные последовательности интегрированных пептидов ОБМ, использовали для дальнейшей трансфекции клеток CHO и получения стабильных клонов-продуцентов рекомбинантных молекул. На втором этапе выполнения проекта подобраны оптимальные условия трансфекции клеток линии СНО генетическими конструкциями, проведена селекция антибиотиком полученных трансфектом СНО и дальнейшее расклонирование методом предельных разведений. Получены моноклональные линии клеток-продуцентов выбранных фрагментов основного белка миелина, слитных с константными фрагментами иммуноглобулинов мыши. Выбраны клоны-продуценты и подобраны условия для максимальной эффективности и стабильности экспрессии целевых рекомбинантных белков. Проведена криоконсервация наиболее эффективных клонов-продуцентов. Рекомбинантные молекулы иммуноглобулинов мыши, слитные с фрагментами основного белка миелина наработаны в препаративных количествах. Для выделения индивидуальных белков проведена двухстадийная очистка рекомбинантных белков. Проанализирована степень гомогенности очищенных молекул, полученные рекомбинантные белки были изучены рядом физико-химических методов, в том числе масс-спектрометрией, проведено определение N-концевой последовательности. Проведен анализ их функциональной активности in vitro на бесклеточных системах с помощью гибридизации очищенных молекул с анти-ОБМ антителами методом Вестерн-блоттинга и ИФА. Для подтверждения возможности активации каскада системы комплемента методом ИФА, определена степень связывания полученных белков с C1q-компонентом системы комплемента в сравнении с полноразмерными антителами. Показано, что созданные рекомбинантные белки взаимодействуют с молекулой C1q со сравнимой аффинностью. На последнем этапе выполнения проекта на бесклеточных системах с антителами класса IgG из сыворотки больных мышей было показано, что фрагмент ОБМ в составе рекомбинантной молекулы эффективно гибридизуется с антителами, связывающими полноразмерный ОБМ и его фрагменты из библиотеки его эпитопов. Методом проточной цитофлуориметрии было доказано, что при введении цитотоксических молекул происходит уменьшение количества популяции В-клеток, специфичных к ОБМ, по сравнению с общим количеством В-лимфоцитов. Созданные рекомбинантные молекулы были использованы для проведения терапии ЕАЕ в мышах линии SJL/J. Эффективность терапии оценивалась по шкале интенсивности развития симптомов патологии. Было обнаружено, что цитотоксические молекулы 7MBP-Fc и 12MBP-Fc обладают значительным терапевтическим эффектом, превосходящим препарат Copaxone. Показано, что введение данных молекул не только более эффективно подавляет развитие симптомов ЕАЕ, но и приводит к полному выздоровлению животных после стадии первичного обострения.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. | Разработка подходов к терапии рассеянного склероза путем селективной элиминации аутореактивных В-клеток |
Результаты этапа: Мыши аутоиммунной линии SJL были получены из питомника Harlan (UK) и содержались в виварии филиала Института Биоорганической Химии РАН в г. Пущино в стерильных условиях, минимизирующих контакт иммунной системы с внешними антигенами (Specific Pathogen-Free статус) в соответствии с правилами по содержанию лабораторных животных. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) удалось развить у трех групп животных: мышей линии SJL/J, C57/BL6, и крыс линии DA. У животных был произведен отбор крови, и проведен анализ сывороток крови на наличие антител к основному белку миелина (МВР), а также определен уровень иммуноглобулинов к МВР. Данные по уровню иммуноглобулинов получены в сравнении с сыворотками других животных, а также с сыворотками пациентов, страдающих рассеянным склерозом. Для подтверждения наличия прямой корреляции между степенью проявления симптомов ЕАЕ и титра аутоантител к МВР проведен анализ сывороток животных во всех экспериментальных группах методом ИФА по схеме sandwich ELISA. Показано, что уровень иммуноглобулинов к основному белку миелина в сыворотке крови мышей линии SJL/J с индуцированным EAE значительно выше, чем в сыворотке крови мышей линии C57/BL6 с EAE, крыс линии DA c ЕАЕ, а также пациентами с рассеянным склерозом (РС). В сыворотках крови мышей BALB/c (линия условно здоровых мышей) иммуноглобулинов к МВР не обнаруживается. Проведено исследование специфичности аутоантител с помощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пептидов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной последовательности MBP. Для этого созданы двенадцать генноинженерных конструкций, содержащих последовательности, кодирующие различные фрагменты основного белка миелина человека на основе экспрессионного вектора pET-32b-CH(+). Функциональная релевантность эпитопной библиотеки подтверждена путем гибридизационного анализа с использованием моноклональных антител к фрагменту основного белка миелина и c-myc эпитопу. Определены фрагменты МВР – потенциальные эпитопы аутореактивных В-клеток с помощью тестирования связывающей активности поликлонального пула иммуноглобулинов из сыворотки крови мышей линии SJL, развивающих EAE, по отношению к эпитопной библиотеке MВР. Уровни аутоантител к фрагментам MBP 25-54 (3), MBP 65-132 (6-8) и 145-170 (12) в сравнении с контрольным белком-носителем были достоверно выше в сыворотке крови мышей EAE SJL. По результатам анализа предполагается, что основной сайт связывания с сывороточными антителами мышей с индуцированным ЕАЕ целиком включает в себя последовательность пептида 7 (TQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPS), а также C-концевую последовательность пептида 6 (QDENPVVHFFK) и N-концевую последовательность пептида 8 (FKNIVTPRTPPPSQG). На основе произведенного анализа нами были выбраны следующие фрагменты ОБМ для дальнейших исследований: пептиды 3, 7, 11, 12 и их укороченные варианты. Созданы генетические конструкции, кодирующие последовательности константных доменов иммуноглобулинов мыши, слитных с фрагментами основного белка миелина, на которые вырабатывается иммунный ответ. Проведено клонирование выбранных фрагментов основного белка миелина в эукариотические вектора, содержащие константные фрагменты иммуноглобулинов мыши. Плазмидные ДНК, содержащие корректные последовательности интегрированных пептидов ОБМ, использовали для дальнейшей трансфекции клеток CHO и получения стабильных клонов-продуцентов рекомбинантных молекул, содержащих фрагмент ОБМ, слитный с константным доменом иммуноглобулина мыши. | ||
2 | 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. | Разработка подходов к терапии рассеянного склероза путем селективной элиминации аутореактивных В-клеток |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта на данном этапе подобраны оптимальные условия трансфекции клеток линии СНО генетическими конструкциями, полученными на предыдущем этапе выполнения проекта, проведена селекция антибиотиком полученных трансфектом СНО и дальнейшее расклонирование полученных трансфектом методом предельных разведений. Получены моноклональные линии клеток-продуцентов выбранных фрагментов основного белка миелина слитных с константными фрагментами иммуноглобулинов мыши. Методом ИФА были отобраны клоны-продуценты, наиболее эффективно экспрессирующие целевые рекомбинантные белки. Проведен отбор стабильных клонов-продуцентов и подбор условий экспрессии, необходимых для достижения максимального уровня продукции целевых белков. В заключение была проведена криоконсервация наиболее эффективных клонов-продуцентов. Рекомбинантные молекулы иммуноглобулинов мыши, слитных с фрагментами основного белка миелина были наработаны в препаративных количествах. Для выделения индивидуальных белков была проведена двухстадийная очистка рекомбинантных белков. Степень гомогенности очищенных молекул была проанализирована методом электрофореза в ПААГ. В дополнение полученные рекомбинантные белки были изучены рядом физико-химических методов, в том числе масс-спектрометрией, также определена их N-концевая последовательность. Для характеристики полученных препаратов in vitro был проведен анализ их функциональной активности на бесклеточных системах с помощью гибридизации очищенных молекул с анти-ОБМ антителами методом вестерн-блоттинга и ИФА. Кроме того, для подтверждения возможности активации каскада системы комплемента методом ИФА была определена степень связывания полученных белков с C1q-компонентом системы комплемента в сравнении с полноразмерными антителами. Показано, что созданные рекомбинантные белки взаимодействуют с молекулой C1q со сравнимой аффинностью. | ||
3 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Разработка подходов к терапии рассеянного склероза путем селективной элиминации аутореактивных В-клеток |
Результаты этапа: На бесклеточных системах с антителами класса IgG из сыворотки больных мышей было показано, что фрагмент ОБМ в составе рекомбинантной молекулы эффективно гибридизуется с антителами, связывающими полноразмерный ОБМ и его фрагменты из библиотеки его эпитопов. Методом проточной цитофлуориметрии было показано изменение количества популяции В-клеток, специфичных к ОБМ, по сравнению с общим количеством В-лимфоцитов при введении цитотоксических молекул. Созданные рекомбинантные молекулы были использованы для проведения терапии ЕАЕ в мышах линии SJL/J. Эффективность терапии была оценена по шкале интенсивности развития симптомов патологии. Было показано, что цитотоксические молекулы 7MBP-Fc и 12MBP-Fc обладают значительным терапевтическим эффектом, превосходящим препарат Copaxone. Введение данных молекул не только более эффективно подавляет развитие симптомов ЕАЕ, но и приводит к полному выздоровлению животных после стадии первичного обострения. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".