ИСТИНА

Проект направлен на решение актуальной научной проблемы создания научно обоснованных эффективных дистанционных методов непрерывного контроля состояния водных фотосинтезирующих организмов (в частности, цианобактерий) с использованием их оптических характеристик. Цианобактерии в большой степени определяют состояние не только водной, но всей глобальной экосистемы: они производят значительную часть первичной продукции на Земле и являются одним из немногих видов, способных фиксировать атмосферный азот. Однако, существуют виды цианобактерий, которые несут ответственность за токсичное цветение, происходящее ежегодно в озерах и солоноватых водах, например, в Балтийском море. Обладая большой устойчивостью к изменениям факторов среды, цианобактерии начинают доминировать в фитопланктонном сообществе при неблагоприятных изменениях факторов среды со всеми вытекающими из этого последствиями для устойчивости экосистемы. Создание новых экспрессных дистанционных методов диагностики состояния этого компонента водной экосистемы является актуальной задачей, решение которой стимулируется как фундаментальными проблемами фотоники цианобактерий, так и целым рядом приложений: оценка первичной продукции, ранний прогноз цветения, непрерывный контроль процесса наработки биомассы цианобактерий, используемой в качестве биотоплива, в водных резервуарах большой протяжённости и др. Научная новизна поставленной в проекте задачи состоит в создании основанного на результатах фундаментальных исследований оптического дистанционного метода диагностики одного из важнейших представителей водной биоты – цианобактерий. Метод будет использовать уникальные особенности флуоресценции цианобактерий и позволит определять не только содержание цианобактерий в природных водах, но и их физиологическое состояние, что важно для решения указанных выше прикладных задач, актуальность которых стремительно нарастает в настоящее время. Новым, применительно к биофотонике цианобактерий, является планируемое в проекте согласованное использование информации о характеристиках спектра флуоресценции цианобактерий, получаемой как со спутников нового поколения, так и с помощью подспутниковых флуориметров нескольких типов, работающих как в линейном, так и в нелинейном режимах возбуждения. Задача такого масштаба в оптике океана ранее не ставилась.

Итоговые результаты проекта в целом будут приведены по окончании проекта, в декабре 2016 года. Итоги 1-го этапа: Проект направлен на развитие методов био-оптической дистанционной диагностики цианобактерий в природных водах с использованием данных оптических сенсоров орбитальных спутников и in situ флуориметрии. На первом этапе проекта возможности этих двух типов средств в диагностике цианобактерий исследовались по-отдельности. Сигнал флуоресценции природных вод при возбуждении в видимом диапазоне имеет сложную структуру и зависит от многих факторов, включая длину волны возбуждения, присутствия/отсутствия определенных веществ, органических соединения и биологических объектов (в основном, фитопланктона), а также внешних факторов окружающей среды. За последние десятилетия удалось выработать алгоритмы выделения сигналов фитопланктона (а именно, флуоресценции хлорофилла а) из общего сигнала флуоресценции природных вод, а также сделать первые шаги по определению физиологического состояния фитопланктона на основании сигналов флуоресценции и влиянию различных факторов среды на данный сигнал. Большая часть фитопланктонного сообщества имеет лишь одну полосу флуоресценции в видимом диапазоне (полосу флуоресценции хлорофилла а), поэтому существующие методы диагностики фитопланктона (включая спутниковые методы и in situ флуориметрию) «заточены» для анализа именно сигнала хлорофилла а. Цианобактерии также содержат хлорофилл а в качестве светособирающего пигмента, но имеют несколько дополнительных полос флуоресценции в диапазоне 550-670 нм, относящихся к флуоресценции фикобилинов. Несмотря на то, что к настоящему моменту известны подробности расположения флуоресцирующих пигментов в фотосинтетическом аппарате цианобактерий и теоретически возможно создание модели формирования отклика флуоресценции цианобактерий из общих принципов, данная модель будет содержать слишком большое число независимых параметров и будет малопригодна для обработки экспериментальных данных. В связи с этим, для эффективного решения задачи био-оптической диагностики цианобактерий необходимо разработать модель (группу моделей) с оптимальным для проведений in situ подспутниковых наблюдений числом параметров, а также определить чувствительность параметров модели к факторам окружающей среды. Одним из подходов, использовавшийся авторами проекта, заключался в разработке ряда моделей, которые позволяют исследовать отклик различных частей фотосинтетического аппарата цианобактерий на внешнее воздействие (световой стресс, недостаток минерального питания и др.) на временах от нескольких десятков пикосекунд до нескольких десятков минут. Реализация этой программы в рамках плана на отчётный этап проекта (вторую половину 2014 года) позволило получить ряд новых результатов, составивших научную основу для выполнения проекта в целом. Развиты модели формирования флуоресцентного отклика цианобактерий при оптическом возбуждении, позволяющие приступить к разработке (на следующих этапах проекта) протоколов флуоресцентной диагностики цианобактерий в природных водах. Показано, что: (а) эти модели достаточно адекватно описывают эффекты тушения (восстановления) флуоресценции при формировании (распаде) тушащего центра в светособирающем комплексе цианобактерий после продолжительного периода избыточного освещения и позволяют определять константы скоростей тушения (восстановления); (б) хлорофилл-содержащий светособирающий комплекс цианобактерий не принимает непосредственного участия в механизме нефотохимического тушения; (в) данные модели могут быть использованы для определения констант переноса энергии в светособирающем комплексе фикобилисомы при пикосекундном лазерном возбуждении; (г) с использованием данных пикосекундной флуорометрии и метода индукции и релаксации флуоресценции модели позволяют определять константы скорости разделения и рекомбинации зарядов в реакционном центре, а также константы скоростей диссипации и квантовые выходы диссипации энергии в антенне и реакционном центре; (д) определяемые в рамках данного подхода параметры чувствительны к световому и другим видам стрессов, что позволяет использовать созданную модель при оценке влияния внешних факторов среды на первичные процессы фотосинтеза в цианобактериях. Сравнительный анализ спектральных и фотофизических характеристик цианобактерий и других таксономических групп фитопланктона показал, что (а) цианобактерии обладают аномально малыми оптическими сечениями поглощения фотосистемы 2 (σФС2): при возбуждении в синем спектральном диапазоне величины σФС2цианобактерий в 3-5 раз ниже, чем σФС2 зеленых водорослей и в 4-8 раз меньше чем у диатомовых и кокколитофорид; (б) в отличие от бурых, зеленых водорослей и кокколитофорид, эффективные оптические сечения поглощения фотосистемы 2 возрастают (в 2-5 раза) при переходе от синего к зеленому и оранжевому спектральному диапазону, при этом максимальные значения σФС2 наблюдаются в зеленом диапазоне для цианобактерий с большим содержанием фикоэретрина и в оранжево-красном диапазоне для цианобактерий с повышенным содержанием фикоцианина; (в) цианобактерии обладают пониженными величинами Fv/Fm (квантовая эффективность Фотосистемы 2), которые не превышают Fv/Fm =0.50 по сравнению с Fv/Fm =0.62-0.66 у диатомовых, динофлагеллятов и зеленых водорослей; измеряемые величины Fv/Fm уменьшаются (на 10-30%) при возбуждении в зеленом и оранжевом спектральных диапазонах, по сравнению с возбуждением на 450 нм, причём сильная спектральная зависимость Fv/Fm наблюдается только у цианобактерий и отсутствует у диатомовых, дигофлагеллят и зеленых водорослей; (г) неблагоприятные факторы окружающей среды (такие как недостаток минерального питания) приводят к уменьшению Fv/Fm, а также увеличению эффективного оптического сечения поглощения фотосистемы 2 (σФС2), при этом наиболее сильное (до 50-60%) уменьшение Fv/Fm наблюдается при недостатке железа. Были продемонстрированы возможности метода индукции и релаксации флуоресценции и метода нелинейной лазерной флуорометрии, а также их совместного применения, для исследования физиологического состояния цианобактерий (на примере Synechocystis sp.). Второе («спутниковое») направление исследований было посвящено - на первом этапе проекта - поиску характеристик цветения цианобактерий в морях и океанах, которые могут быть рассчитаны по данным спутниковых сканеров цвета океана (СЦО) и использованы как показатели эволюции цветений. Обычно под цветением понимается такое состояние бассейна, при котором достигнута условная пороговая концентрация цианобактерий по данным традиционных судовых наблюдений или пороговое значение коэффициента яркости Rrs водной поверхности по данным СЦО. Однако пороговые оценки Rrs могут быть обусловлены явлениями, не связанными с содержанием цианобактерий в море, что особенно вероятно во внутренних морях, проливах и прочих переходных акваториях. Дополнительные характеристики цветения могли бы снизить риск ложных определений и повысить информативность дистанционного зондирования. По литературе и сетевым источникам мы выяснили, что цветения цианобактерий в Балтийском море описаны с требуемой полнотой и доступны на портале комиссии HELCOM. Эти материалы основаны на регулярных определениях количества и состава цианобактерий международным коллективом специалистов под эгидой того же комитета и охватывают период с 2003 по 2014 г. Для этих региона и периода имеются определения спектральной яркости моря, выполненные сканерами SeaWiFS, MODIS и MERIS, свободно доступные на портале NASA, а также вспомогательные материалы о свойствах среды, например, на сервере LAS. Такое сочетание источников первичной информации позволило обойтись без затратных подспутниковых наблюдений на начальном этапе проекта. Как известно, пигментные системы любых водорослей содержат хлорофилл а, но различаются по составу дополнительных пигментов. Поэтому в рамках проекта важно выяснить, в чем и в какой степени проявляется вклад светопоглощения и флуоресценции дополнительных пигментов цианобактерий в спутниковых оценках коэффициентов яркости Rrs акваторий, охваченных цветением этих водорослей. Трудность в том, что указанные СЦО регистрируют яркость моря не в виде непрерывного спектра, а лишь в нескольких спектральных полосах, и потому здесь неприменимо определение составляющих путем деконволюции сложного сплошного спектра. Поэтому параллельно с составлением коллекции цифровых изображений Балтийского моря, полученных с помощью сканеров MODIS и MERIS за указанный период, был предложены и реализованы приемы для выявления вклада цианобактерий в оценки Rrs. Они были реализованы на примере изображений района Готландской впадины, полученных в 2005 г., когда июльское цветение цианобактерий было там рекордно интенсивным. Используя сплайн-интерполяцию для восстановления непрерывного спектра по оценкам Rrs на длинах волн от 469 до 555 нм (MODIS), мы убедились в том, что у всех пикселей (элементов изображения) вдоль меридиональной 500-километровой в глубоководной части полигона длина волны максимума спектра Rrs приходилась на интервал 520-540 нм до и после цветения, но смещалась к пределу 555 нм в разгар цветения цианобактерий. Такое смещение естественно объяснить тем, что пик поглощения фикоцианина (одного из дополнительных пигментов цианобактерий) лежит в зеленой области спектра и потому обилие цианобактерий усиливает здесь светопоглощение, смещая оценки Lm к длинноволновому краю спектра. Часть пикселей июльского изображения полигона по данным MERIS'а отличалась спектрами с "провалом" на длине волны 443 нм по сравнению с Rrs(413) и Rrs(490). Используя разность D=Rrs(443)-Rrs(412) как простейший показатель "провала" (если он существует, то D < 0), мы построили карты величин D и Rrs(560) в период цветения, когда Rrs(560) отражает их присутствие на полигоне, многократно превышая фоновые значения до и после цветения. На карте Rrs(560) от 14 июля 2005 г. один из стойких элементов его структуры выглядела как линейный максимум длиной более 50 км при поперечнике до 5 км. Благодаря своей четкости и узнаваемости, этот максимум Rrs(560) удобен для проверки предположения о том, что появление оценок D < 0 обусловлено повышенным поглощением света хлорофиллом на длине волны максимума полосы Соре там, где скапливаются цианобактерии. Если это так, то контур минимума оценок D должен совпадать с контуром максимума Rrs(560) на месте описанной линейной структуры на снимке от 14 июля. Несмотря на сильную зашумленность распределения D, неизбежную для разности близких по модулю величин, условие совмещенности указанных контуров было в точности выполнено. Подобным образом совмещались минимумы оценок D с максимумами Rrs(560) и на остальных участках изображения полигона, так что распределения D и Rrs(560) соотносились как негатив и позитив. Описанный сценарий повторился, когда те же распределения были построены по данным сканера MODIS для той же даты. Разница лишь в том, что во втором случае минимум D был не так глубок, как в первом. Подчеркнем, что спектры Rrs с минимумом на длине волны максимума поглощения полосы Соре крайне редко наблюдаются на акваториях океанов и морей. Аналогичный прием был применен, чтобы выяснить, нельзя ли использовать индекс цвета Ic = Rrs(560)/Rrs(665) как показатель наличия фикоцианина в верхнем слое моря. Дело в том, что Rrs(560) приходится на область полосы поглощения фикоцианина, а Rrs(665) - на область полосы его флуоресценции. Если она достаточно эффективно возбуждается солнечным излучением, то минимальные Ic должны наблюдаться в разгар цветения цианобактерий, а максимальные - в его отсутствие. Используя исходные данные от 14 июля 2005 г., мы убедились в том, что распределения Rrs(560) и Ic соотносятся как позитив и негатив не менее точно, чем в предыдущем случае. Публикации по результатам 1-го этапа: Ф.И. Кузьминов, Е.А. Ширшин, М.Ю. Горбунов, В.В. Фадеев. НОВЫЕ ОПТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В ИССЛЕДОВАНИИ ФОТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЦИАНОБАКТЕРИЙ IN SITU . Журнал фундаментальной и прикладной гидрофизики. (Принята к печати в № 1, 2015) E.G. Maksimov, K.E. Klementiev, E.A. Shirshin, G.V. Tsoraev, I.V. Elanskaya, and V.Z. Paschenko Features of temporal behavior of fluorescence recovery in Synechocystis sp. PCC6803, Photosynthesis Research, 2015 (in press). Итоги этапа 2. На 2-ом этапе проекта (в 2015 году) получены следующие результаты: - Разработаны лабораторные макеты приборов для in situ флуориметрии: (а) лазерный спектрометр с оптоволоконным приёмо-передающим кабелем-зондом со значениями длины волны возбуждающего излучнения, сопряжёнными с полосами поглощения хлорофилла а и фикобилинов, с плавной перестройкой интенсивности лазерного излучения в диапазонах формирования кривых насыщения флуоресценции цианобактерий и водорослей; (б) FIRe флуориметр, специализированный под задачи функциональной диагностики цианобактерий в природных водах. - Разработаны методы выделения флуоресцентного сигнала от цианобактерий in situ на фоне сигнала от других групп фитопланктона. - Установлены закономерности и механизмы влияния факторов среды на фотофизические параметры цианобактерий и на коэффициенты спектральной яркости акваторий. В частности, показано, что деструкция клеток цианобактерий в период цветения, которая может сопровождаться заражением водной среды цианотоксинами, приводит к изменениям формы спектра поглощения (может фиксироваться спутниковыми радиометрами) и изменением значений фотофизических параметров, определяемых методом индукции и релаксации флуоресценции (методом FIRe), реализуемым при контактных измерениях in situ. - Разработаны алгоритмы и программы анализа изображений, формируемых оптическими сенсорами спутников, для выявления признаков присутствия цианобактерий в природных водах разной трофности. - Пополнены коллекции мульти- и гиперспектральных изображений с использованием разработанных алгоритмов и программ, в частности, пополнены коллекции спутниковых изображений Балтийского моря материалами сканера SeaWiFs, начиная с 1998 г., получено более 200 цифровых изображений Балтийского моря с записями распределений более 10 коэффициентов яркости и производных величин. - В результате анализа изображений: (а) определён сезонный ход ИЦЦ, получены численные оценки их межгодовых и сезонных вариаций, выявлены взаимозависимости ИЦЦ; (б) получены численные оценки расчлененности яркостного рельефа в зависимости от времени года и интенсивности цветения цианобактерий, используя для этого средства геостатистики. Созданы программы-сценарии в среде MATLAB для обработки спутниковых данных. Статьи с результатами, полученными по данному проекту в 2015 году: 1. Maksimov, E. G., Shirshin, E. A., Sluchanko, N. N., Zlenko, D. V., Parshina, E. Y., Tsoraev, G. V., Klementiev K. E.,Budylin G.S., F.-J. Schmitt, T. Friedrich, Fadeev V. V., Paschenko V. Z., & Rubin, A. B. (2015). The Signaling State of Orange Carotenoid Protein. Biophysical Journal, 109(3), 595-607. (WoS, Scopus) 2. Maksimov, E. G., Klementiev, K. E., Shirshin, E. A., Tsoraev, G. V., Elanskaya, I. V., & Paschenko, V. Z. (2015). Features of temporal behavior of fluorescence recovery in Synechocystis sp. PCC6803. Photosynthesis research, 1-12. (WoS, Scopus) 3. Kuzminov, F. I., & Gorbunov, M. Y. (2015). Energy dissipation pathways in Photosystem 2 of the diatom, Phaeodactylum tricornutum, under high-light conditions. Photosynthesis research, 1-17. (WoS, Scopus) 4. Кузьминов Ф.И., Ширшин Е.А., Горбунов М.Ю., Фадеев В.В.(2015) Новые оптические подходы в исследовании фотофизиологических характеристик цианобактерий in situ . Журнал фундаментальной и прикладной гидрофизики, 2015, том 8, № 1, c. 41-47. (РИНЦ) 5. Г.С. Карабашев, М.А. Евдошенко (2015). Спектральные признаки цветения цианобактерий в Балтийском море по данным сканера MODIS. Современные проблемы дистанционного зондирования Земли из космоса. 2015. Т. 12. № 3. С. 158-170. (РИНЦ) 6. Karabashev G.S., M.A. Evdoshenko (2015) . Manifestations of pigment absorbance in multispectral satellite images of cyanobacterial blooms in the Baltic Sea and South Western Tropical Pacific. International Journal of Remote Sensing (UK), in press (WoS, Scopus) 7. E. Shirshin, F. Kuzminov, E. Maksimov, M. Gorbunov, V. Fadeev (2015). Analysis of fluorescence recovery after non-photochemical quenching in cyanobacteria using enzyme kinetics approach. FEBS Open, in press (WoS, Scopus)