ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
По последним данным, мутации в митохондриальном геноме встречаются примерно у каждого 250-го жителя Земли. Зачастую такие мутации приводят к развитию тяжелых наследственных заболеваний, в основном, нейромышечного характера. Пациенты с такими заболеваниями характеризуются крайне низким качеством жизни и малой ее продолжительностью. В медицинской практике для лечения митохондриальных болезней в настоящее время используют исключительно симптоматические подходы, которые часто оказываются неэффективными и совершенно не решают проблемы передачи болезни потомкам пациентов. В научной литературе описано несколько генно-терапевтических стратегий супрессии мутаций в митохондриальном геноме, однако все они еще очень далеки от внедрения в медицинскую практику. Таким образом, глобальной задачей настоящего проекта является создание новых и/или совершенствование существующих генно-терапевтических подходов к лечению митохондриальных болезней человека с целью их дальнейшего использования в медицине. В качестве возможных путей решения задачи проекта мы предлагаем два пути. Оба они основаны на процессах импорта нуклеиновых кислот в митохондрии. Именно этот процесс является основой самых эффективных из описанных к настоящему моменту генно-терапевтических стратегий супрессии мутаций в митохондриальном геноме. Вкратце, суть данных стратегий заключается в доставке в митохондрии молекул нуклеиновых кислот, которые либо функционируют в органеллах вместо мутантных молекул, либо тем или иным образом подавляют экспрессию митохондриальной ДНК, несущей мутацию. В обоих случаях митохондриальная функция может частично восстанавливаться до значений, близких к нормальным. Первый путь решения задачи проекта - это совершенствование уже разработанных стратегий супрессии мутаций в митохондриальном геноме. Для этого потребуется, во-первых, увеличение объема наших знаний относительно молекулярных механизмов процесса импорта нуклеиновых кислот в митохондрии, а во-вторых, работы, направленные на создание новых генетических конструкций, обладающих повышенной эффективностью импорта в митохондрии и супрессии патогенных мутаций в геноме органелл. Второй путь решения задачи проекта - это разработка новых способов доставки нуклеиновых кислот в митохондрии. Доставка в условиях in vivo может происходить либо по естественным механизмам импорта нуклеиновых кислот, либо посредством белков-переносчиков. Мы планируем разработать новые белки-переносчики, обладающие высоким сродством к молекулам нуклеиновых кислот и способных импортироваться в органеллы в комплексе с ними.
1 Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ. 2 Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96. 3 Экспериментальный образец генетической конструкции, способной импортироваться в митохондрии и супрессировать точечные мутации или делеции в митохондриальном геноме. 4 Методики доставки генетической конструкции в митохондрии и супрессии ей мутаций в митохондриальном геноме 5 Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики. 6 Проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологии супрессии мутаций в митохондриальном геноме».
В ходе выполнения работ были обоснованы требования к генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций. Генетическая конструкция представляет собой линейную двуцепочечную ДНК размером 5042 п.н. что практически соответствует размеру "основной делеции" в митохондриальном геноме человека. Установлено, что выбранная в результате теоретических работ генетическая конструкция проникает в изолированные митохондрии дрожжей, если она была предварительно связана с полноразмерным дрожжевым белком Abf2p. Показано, что клетки человека содержат систему импорта нуклеиновых кислот в митохондрии, организованную аналогично изученной дрожжевой системе. Были разработаны и обоснованы методы и средства доставки генетической конструкции в митохондрии, методы и средства оценки эффективности доставки генетической конструкции в митохондрии, методы и средства оценки эффективности супрессии делеций в митохондриальном геноме с помощью генетической конструкции путем проведения процесса гомологичной рекомбинации. Наработанная генетическая конструкция предназначена для коррекции митохондриальной дисфункции, вызываемой мутациями в митохондриальном геноме человека, в частности созданная генетическая конструкция может супрессировать мутацию известную под названием «основная делеция» размером 4977 п.н. (8483–13459), являющуюся причиной тяжелых наследственных заболеваний человека, объединенных под общим названием Синдром Кернса-Сейра (сокращенно KSS). Проведены испытания образца генетической конструкции, заложенной на хранение в осажденном виде при +4 С на 1 месяц.Два образца генетической конструкции заложены на хранение на 1 год: в лиофилизированном виде при температуре +20 С; в осажденном виде при температуре -20 С. Наработанная генетическая конструкция - продукт ПЦР, линейная ДНК, размером 5042 п.н, соответствующая области митохондриального генома, удаляющейся из него в результате «основной делеции». Итоговый размер ДНК 3227 кДа. В ходе испытаний выявлено, что после проникновения генетической конструкции в клетки человека происходит восстановление параметров митохондриальных функций: снижается на 49% уровень гетероплазмии и на 370 % увеличивается скорость поглощения кислорода. Испытания генетической конструкции, заложенной на хранение на 1 месяц в осажденном виде при +4С подтверждают сохранение её функциональности: гетероплазмия снижается на 45%, а поглощение кислорода увеличивается на 360%. Концентрация ДНК в экспериментальном образце 0,08 мкг/мл. Количество генетической конструкции 18 мкг в каждом из 4 экспериментальных образцов. Ее детекция в митохондриях производилась методами радиоавтографии. Генетическая конструкция разработана при помощи современных методов генетической инженерии, а выбранный способ доставки белково-нуклеиновой конструкции через мембрану митохондрий позволит создать новаторский метод корректировки механизмов супрессии мутаций в митохондриальном геноме. Полученные теоретические и экспериментальные результаты четырех этапов ПНИ полностью удовлетворяют техническим требованиям проекта, а также дают нам возможность завершить выбранное направление исследований согласно плану–графику и техническому заданию Соглашения о предоставлении субсидии. 4) Настоящие исследования и результаты экспериментальной части соответствуют уровню мировых аналогов, что подтверждается их публикацией в международных научных журналах
ФЦП: Федеральная целевая программа, Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы |
# | Сроки | Название |
1 | 1 августа 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Выбор направления исследований. Теоретические исследования поставленных перед НИР задач. Предварительные экспериментальные исследования. |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2015 г.-30 июня 2015 г. | Предварительная разработка генетической конструкции для супрессии мутаций в митохондриальном геноме |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 июля 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Разработка методов и средств работы генетической конструкции как супрессоров мутаций в митохондриальном геноме |
Результаты этапа: | ||
4 | 1 января 2016 г.-30 июня 2016 г. | Разработка лабораторного регламента получения генетической конструкции для коррекции митохондриальной дисфункции, вызываемой мутациями в митохондриальном геноме |
Результаты этапа: В ходе выполнения работ были обоснованы требования к генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций. Генетическая конструкция представляет собой линейную двуцепочечную ДНК размером 5042 п.н. что практически соответствует размеру "основной делеции" в митохондриальном геноме человека. Установлено, что выбранная в результате теоретических работ генетическая конструкция проникает в изолированные митохондрии дрожжей, если она была предварительно связана с полноразмерным дрожжевым белком Abf2p. Показано, что клетки человека содержат систему импорта нуклеиновых кислот в митохондрии, организованную аналогично изученной дрожжевой системе. Были разработаны и обоснованы методы и средства доставки генетической конструкции в митохондрии, методы и средства оценки эффективности доставки генетической конструкции в митохондрии, методы и средства оценки эффективности супрессии делеций в митохондриальном геноме с помощью генетической конструкции путем проведения процесса гомологичной рекомбинации. Наработанная генетическая конструкция предназначена для коррекции митохондриальной дисфункции, вызываемой мутациями в митохондриальном геноме человека, в частности созданная генетическая конструкция может супрессировать мутацию известную под названием «основная делеция» размером 4977 п.н. (8483–13459), являющуюся причиной тяжелых наследственных заболеваний человека, объединенных под общим названием Синдром Кернса-Сейра (сокращенно KSS). Проведены испытания образца генетической конструкции, заложенной на хранение в осажденном виде при +4 С на 1 месяц. Два образца генетической конструкции заложены на хранение на 1 год: в лиофилизированном виде при температуре +20 С; в осажденном виде при температуре -20 С. 1) Наработанная генетическая конструкция - продукт ПЦР, линейная ДНК, размером 5042 п.н, соответствующая области митохондриального генома, удаляющейся из него в результате «основной делеции». Итоговый размер ДНК 3227 кДа. В ходе испытаний выявлено, что после проникновения генетической конструкции в клетки человека происходит восстановление параметров митохондриальных функций: снижается на 49% уровень гетероплазмии и на 370 % увеличивается скорость поглощения кислорода. Испытания генетической конструкции, заложенной на хранение на 1 месяц в осажденном виде при +4С подтверждают сохранение её функциональности: гетероплазмия снижается на 45%, а поглощение кислорода увеличивается на 360%. Концентрация ДНК в экспериментальном образце 0,08 мкг/мл. Количество генетической конструкции 18 мкг в каждом из 4 экспериментальных образцов. Ее детекция в митохондриях производилась методами радиоавтографии. 2).Генетическая конструкция разработана при помощи современных методов генетической инженерии, а выбранный способ доставки белково-нуклеиновой конструкции через мембрану митохондрий позволит создать новаторский метод корректировки механизмов супрессии мутаций в митохондриальном геноме. 3) Полученные теоретические и экспериментальные результаты четырех этапов ПНИ полностью удовлетворяют техническим требованиям проекта, а также дают нам возможность завершить выбранное направление исследований согласно плану–графику и техническому заданию Соглашения о предоставлении субсидии. 4) Настоящие исследования и результаты экспериментальной части соответствуют уровню мировых аналогов, что подтверждается их публикацией в международных научных журналах. | ||
5 | 1 июля 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Обобщение и оценка результатов исследований |
Результаты этапа: Разработана генетическая конструкция для эффективной коррекции мутаций в митохондриальном геноме, являющихся причиной наследственных заболеваний человека. Разработаны методики оценки эффективности действия созданной генетической конструкции, предназначенной для коррекции митохондриальной дисфункции, вызываемой мутациями в митохондриальном геноме. В частности, разработан лабораторный регламент получения генетической конструкции для коррекции митохондриальной дисфункции, вызываемой мутациями в митохондриальном геноме, получены экспериментальные образцы генетической конструкции для коррекции митохондриальной дисфункции, проверена нормальная работа генетической конструкции после ее хранения в разных условиях, проведены исследовательские испытания генетической конструкции. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".