ИСТИНА

Проект направлен на выявление новых подходов к решению проблемы создания искусственных биологических пейсмекеров и их применимости в доклинических исследованиях и персонализированной медицине. Согласно клиническим данным, основной причиной смертности в России являются сердечно-сосудистые заболевания и патологии, связанные с нарушением гемодинамической функции сердца. Большую долю составляют нарушения ритма (аритмии) сердца, связанные с подавлением или блокадой проведения возбуждения в атрио-вентрикулярном узле. В связи с этим, создание модели искусственной тканеподобной структуры с фенотипом клеток, соответствующих фенотипу кардиомиоцитов атрио-вентрикулярного узла, является приоритетной задачей для системы здравоохранения.

Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality in the Russian Federation. One of the main reason are arrhythmias, leading to a lack of blood supply. Activation of the ventricular myocardium depends on the arrival of an excitation wave from the atria to the atrioventricular node (AVN) and the conduction system in mammals and humans. The AVN is a key structure that allows ventricular excitation and contraction. At the same time, the AVN is a heterogeneous and vulnerable structure. Small changes in the electrophysiology of one of its sections lead to disruption of AV conduction and the formation of brady/tachyarrhythmias. AV arrhythmias and AV block are much more common than sinus node pathologies (SAN). Among age-related heart disorders, AVN pathologies are the most common. Currently, treatment methods for AVN dysfunction are based on an interventional approach through the implantation of expensive and unreliable pacemakers. It is well known that the cardiomyocytes of the central part of the AVN are similar to those in the SAN. In particular, cardiomyocytes AVN and SAN exhibit pacemaker properties under certain conditions. However, electrophysiologically, at the level of expression of key proteins, as well as in embryonic origin, SAN and AVN cardiomyocytes differ significantly. Thus, significant efforts are aimed at creating an artificial biological pacemaker-like (BPL) cellular structure capable of replacing the AVN. However, the problem of UPS, like the problem of artificial cardiac AVN, has not yet been solved. The functioning of the AVU is determined by tissue electrophysiological characteristics: the sequence of formation of calcium waves and depolarization of cardiomyocyte clusters, as well as the pattern of restoration of the resting state. The reasons for the current ineffectiveness of BPL are due to the fact that their development does not take into account the complex tissue organization, as well as the features of the “activity profiles” of the native AVN. The project is aimed to solve problems related to the problem of creating and researching an artificial structure that reproduces the properties of a native AVN. • The first task is the functional assessment of cell activity in a tissue-like model structure based on a primary monoculture of neonatal cardiomyocytes. • The second objective of the project is aimed at developing a system for stable delivery of genetic material and reprogramming of neonatal cardiomyocytes, allowing to induce a phenotype characteristic of native AVN. • The third objective of the project is to assess the degree to which the phenotype of reprogrammed neonatal cardiomyocytes of a model cell structure approaches the phenotype of native AVN cardiomyocytes. To solve the problems, activity profiles in a cultured model tissue-like cell conglomerate will be assessed using several imaging methods. The development of a genetic material delivery system will make it possible to induce the expression of key transcription factors TBX3, TBX5 and/or ETV1 in neonatal cardiomyocytes and to obtain, based on neonatal cardiomyocytes, a 2D reprogrammed tissue-like culture that stably demonstrates spontaneous activity and models the properties of clusters of native AVN cardiomyocytes. To assess the degree of myocyte differentiation in culture, one of the standard methods used in molecular diagnostics will be selected. The implementation of the project is necessary for the development of clinical methods for cell and tissue therapy for cardiac arrhythmias, as well as cellular correction of the bioelectrical activity of various parts of the heart. The work will use a complex of studies that allows for an integrative approach to solving the assigned problems. The project will conduct experiments with isolated rat cardiomyocytes, electrophysiological and molecular experiments, and apply modern bioengineering technologies to reprogram cardiomyocytes. Such comprehensive studies have not been conducted before.

В настоящее время представление о механизмах функционирования АВ-узла активно дополняется. Множество работ посвящено исследованию молекулярной природы нарушений проведения в АВ-узле, клеточному окружению и эмбриональному происхождению АВ-соединения, а также молекулярно-генетическим механизмам, определяющим дифференцировку миобластов в клетки АВ-узла (Vincent W. et al., 2018, Dobrzynski et al., 2003; Hashem et al., 2013). Данный проект посвящен созданию искусственной биологической клеточной структуры (клеточного конгломерата), воспроизводящей функции и свойства кластеров клеток АВ-узла сердца, которые представляют собой сложный специализированный пейсмекер. В проекте будет применен подход, актуальный и интенсивно используемый в современной науке, основанный на репрограммировании неонатальных недифференцированных клеток. С фундаментальной точки зрения, исследование функциональных, электрофизиологических особенностей, а также профиля экспрессируемых мембранных белков модельной клеточной структуры позволит обогатить представление о взаимодействии клеток в нативном АВ-узле, а также в дальнейшем использовать полученные данные для прикладных целей. Разработка искусственной биологической клеточной структуры со свойствами АВ-узлового пейсмекера (АВ-ИБП) будет основана на использовании первичной культуры неонатальных кардиомиоцитов крысы. Неонатальные кардиомиоциты будут подвергаться репрограммированию, направленному на индукцию фенотипа нативных АВ-узловых клеток. Для репрограммирования будут использованы генетические конструкции для экспрессии ключевых транскрипционных факторов (ТФ - TBX3, TBX5, ETV1), определяющих дифференцировку по АВ-узловому типу. В качестве системы доставки генетического материала предполагается использовать лентивирусные частицы.

Руководитель проекта, Пустовит О.Б., является штатным старшим научным сотрудником кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и с 2012 года занимается исследованиями электрофизиологии сердца в составе научной группы Кузьмина В.С. и Д.В. Абрамочкина. Соответственно, Пустовит О.Б. обладает значительным опытом научной работы как в области электрофизиологии сердца экспериментов, так и клеточно-молекулярной физиологии. Это подтверждается перечисленными ниже публикациями – в том числе в высокорейтинговых международных журналах из первой квартили. Наличие именно такого опыта работы является критически важным для успешного выполнения данного проекта. Пустовит О.Б. владеет навыками работы с животными и методиками выделения первичных культур кардиомиоцитов,рутинного ведения различных клеточных культур, методами кальциевого имиджинга и оптического картирования. А также молекулярными методами диагностики (ПЦР, блоттинг) и базовыми биоинженерными протоколами. В приложенных файлах расположены данные, полученные в ходе пилотных экспериментов, что подтверждает возможность реализации данного Проекта.

В ходе выполнения проекта будут получены следующие принципиально новые результаты: 1. В результате разработки системы доставки генетического материала будут получены оптимальные конструкции и векторы для параллельной или индивидуальной индукции экспрессии транскрипционных факторов TBX3, TBX5 и\илиETV1 в неонатальных митотически-активных кардиомиоцитах при помощи лентивирусов. Для этого будет проведено клонирование и секвенирование генов TBX3, TBX5 и\или ETV1 и получена генетическая векторная конструкция и лентивирусные частицы. Будет получена система контроля экспрессии транскрипционных факторов, основанная на индукции в целевых клетках экспрессии GFP или иного репортера. Будет разработана методика оптимального и стабильного введения генетических конструкций. 2. Будут получены жизнеспособные первичные митотически-активные клеточные слои (первичная клеточная культура). Культура будет выделена из гомогенизированных и обработанных коктейлем ферментов желудочков сердец крысят (возраст крыс - 1 день постнатального развития (Р1), самцы). Неонатальные, митотически-активные кардиомиоциты являются идеальным объектом для формирования искусственных клеточных слоев, однако в ходе пролиферации при культивировании в стандартных условиях при отсутствии тканевого окружения и градиента морфогенетических факторов эти клетки быстро теряют способность к автоматии и миоцитарный фенотип. Трансдукция кардиомиоцитов и индукция в них ТФ (TBX3, TBX5 и\или ETV1), ответственных за экспрессию мембранных белков пейсмекероподобного электрофизиологического фенотипа АВ-узла, позволит получить тканеподобную структуру, стабильно демонстрирующую автоматические свойства, медленный тип активации. 3. Будет проведена оценка особенностей электрической активности репрограммированных кардиомиоцитов в условиях поддерживающего культивирования. Будут получены сведения о паттерне активации (инициации волн возбуждения и охвате слоя клеток возбуждением), паттерне распространения волн колебания концентрации цитоплазматического кальция (кальциевых волн), частотных характеристик спонтанных паттернов сокращений пейсмекероподобных клеток АВ-ИБП. 4. Будут проведены эксперименты, направленные на изучение влияния трансдукции на выживаемость и стабильность культуры. Будут подобраны оптимальные протоколы оценки выживаемости, в зависимости от особенностей культивирования клеток. Для оценки будут использованы методы, основанные на применении бромид3-(4,5- диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ-тест), либо резаузирунового синего, прижизненное окрашивание клеток пропидий йодидом и др. 5. Будет протестирована эффективность формирования фенотипа, характерного для АВ-узловых кардиомиоцитов, в результате индукции экспрессии комбинации ТФ. Для этого будет выбран наиболее подходящий метод: оценка уровня мРНК (РВ-ПЦР) либо оценка экспрессии ТФ и некоторых из ключевых маркерных мембранных белков, характерных для АВ-клеток методом иммуноблоттинга: Nppa, Gja1, Gja5, Scna5, Kcnj2, Kcnj12, Hcn4, Gjc3, Cacna1g, Cacna2d2. В случае успешной индукции экспрессии АВ-узловых маркеров будет проведено РНК-секвенирование программированных кардиомиоцитов и их профилирование по более широкому спектру молекул, определяющих электрофизиологические свойства и межклеточное взаимодействие.