ИСТИНА

Проект посвящен исследованию взаимосвязи структуры и функции цистеиновых пептидаз (ЦП) из семейства С1 (папаина). В ходе выполнения проекта расширятся и уточнятся наши представления об этой группе ферментов и полученные знания могут быть использованы в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и при разработке и производстве косметических средств. Планируется всесторонне проанализировать имеющиеся в публичных базах данных первичные и пространственные структуры ЦП семейства С1 из разных групп организмов, с акцентом на те виды, в которых выявлено большое количество гомологичных генов ЦП. Для успешного биохимического исследования ЦП предполагается осуществить ряд методических разработок. Планируется провести дизайн и синтез селективных пептидных субстратов ЦП. Предложенные флуорогенные субстраты будут использованы для разработки высокочувствительного метода постэлектрофоретического тестирования активности ЦП непосредственно в геле. Предполагается провести дизайн и синтез специфических лигандов и сорбентов для аффинной хроматографии ЦП, необходимых для успешного выделения нестабильных ЦП. Будут выделены, охарактеризованы и идентифицированы секретируемые пищеварительные ЦП из жуков-вредителей запасов зерна, включая первого жука с секвенированным геномом Tribolium castaneum, и злостного вредителя-листоеда колорадского жука Leptinotarsa decemlineata. Предполагается также экспрессировать в клетках дрожжей наиболее важные ЦП насекомых для того, чтобы подробно исследовать их физико-химические и энзиматические свойства. С использованием синтезированных и коммерческих субстратов планируется провести сравнительное исследование субстратной специфичности внеклеточных ЦП на примере пищеварительных пептидаз насекомых (изолированных и рекомбинантных) и растительных пептидаз, а также лизосомальных ЦП млекопитающих. Базируясь на полученных биоинформатических и биохимических данных, планируется провести анализ структурно-функциональных особенностей ЦП из выявленных кластеров в семействе С1. Предлагаемый подход структурно-функционального изучения ЦП в масштабах важнейшего и крупнейшего семейства С1 позволит выйти на новый уровень знаний об эволюции этих пептидаз. Полученные данные о ЦП насекомых позволят также проанализировать роль источников питания в эволюции пищеварительных ЦП у насекомых. Разработанные селективные субстраты и аффинные сорбенты ЦП будут оригинальны, также как и запланированный к разработке высокочувствительный метод постэлектрофоретического тестирования активности ЦП с использованием предложенных флуорогенных субстратов.

Впервые проведен подробный биоинформатический анализ предположительных последовательностей ЦП в транскриптоме из кишечника личинок вредителя запасов зерновых Tenebrio molitor. В результате анализа последовательностей кДНК были найдены соответствующие им последовательности 17 белков, схожих с катепсинами L и им подобными белками, и 15 – с катепсинами В и катепсин В-подобными белками. С использованием 3D моделей ЦП подробно изучена структура субстрат-связывающих центров пептидаз, в число которых входят главные пищеварительные пептидазы этого насекомого. Было выявлено 14 катепсин L-подобных последовательностей, не содержащих замен в а.к. активного центра, но показавших довольно большое разнообразие в сайтах связывания субстрата. Лишь 3 последовательности обладали типичными для катепсинов L а.к. остатками в позициях, ответственных за S1 и S2 субсайты связывания субстрата. Среди катепсин В-подобных белков лишь один содержал замены в а.к. активного центра, однако среди предположительно активных пептидаз лишь три по структуре закрывающей петли и составу а.к. остатков S1 и S2 субсайтов полностью соответствовали типичным катепсинам B. Проанализирована предполагаемая локализация ЦП и им подобных белков из кишечника личинок T. molitor путем анализа присутствия возможных сайтов N-гликозилирования для последующего узнавания маннозо-6-фосфат рецепторами и транспортировки в лизосомы. Показано, что катепсины В и им подобные белки имеют преимущественно лизосомную локализацию, 7 из 10, и только 2 с высокой вероятностью являются пищеварительными. Локализация катепсинов L имеет противоположную тенденцию: лишь 4 из 12 могут быть локализованы в лизосомах, а 8 предположительно могут быть пищеварительными. Анализ существенных особенностей структуры полных последовательностей катепсинов и им подобных белков, имеющих разную локализацию, не позволил выявить какую-либо кластеризацию в пределах групп катепсинов В и L, обусловленную спецификой их функционирования. Предложены, синтезированы химико-энзиматическим методом и охарактеризованы хромогенные Glp-Phe-Ala-pNA, Glp-Val-Ala-pNA и флуорогенные Abz-Phe-Ala-pNA, Glp-Phe-Ala-AMC, Glp-Phe-Ala-AFC субстраты ЦП, а также синтезированный химическим методом хромогенный субстрат Z-Ala-Ala-Gln-pNA. Все исследуемые субстраты расщеплялись растительными ЦП папаином, бромелаином, фицином, и лизосомальными катепсинами В и L быка и человека. Определены кинетические константы гидролиза субстратов исследуемыми ЦП. Флуорогенные субстраты по эффективности гидролиза на порядок превосходили хромогенные. С помощью субстрата Z-Ala-Ala-Gln-pNA показано, что в пищеварительном комплексе личинок T. molitor постглутаминрасщепляющей активностью обладают ЦП. С использованием предложенных флуорогенных субстратов разработан новый метод постэлектрофоретического тестирования активности ЦП непосредственно в ПААГ. Метод позволяет увеличить чувствительность тестирования постэлектрофоретической активности в геле в 3 – 5 раз по сравнению с ранее предложенным нами методом тестирования по хромогенным субстратам, при значительном упрощении самой процедуры определения. Предложен и синтезирован оригинальный сорбент AS(аминосилохром)-АС(аминокапронил)-PQPQPZ для очистки ЦП методом специфической аффинной хроматографии, который позволил за одну стадию разделить ЦП и химотрипсиноподобные сериновые пептидазы. Охарактеризован спектр пищеварительных пептидаз личинок злостного вредителя картофеля – колорадского жука Leptinotarsa decemlineata. Показано, что мажорные протеолитические активности в пищеварительном комплексе личинок представлены как минимум пятью ЦП, в состав которых входят предположительно катепсины B и L. Кроме того, была выявлена группа минорных сериновых пептидаз, представленная двумя трипсино- и двумя химотрипсиноподобными ферментами, проявляющая активность при аппроксимированных «физиологических» условиях в содержимом средней кишки насекомого. проведен структурный анализ последовательностей предположительных цистеиновых пептидаз семейства С1 папаина (ЦП) в транскриптоме кишечника личинок вредителя продуктов переработки зерновых культур Tribolium castaneum в сравнении с охарактеризованными последовательностями гомологичных ЦП. Было выявлено 24 последовательности кДНК, кодирующих белковые последовательности, гомологичные цистеиновым пептидазам семейства папаина С1, из которых только 21 последовательность соответствует активным пептидазам без замен в активных центрах ферментов. Впервые построены 3D модели всех ЦП и проанализирована структура субстрат-связывающих центров ферментов. В результате анализа выявлены 3 основные группы пептидаз: катепсин L-подобные пептидазы, катепсины B, и новая группа катепсин В-подобных пептидаз, не несущих дополнительный активный центр на закрывающей петле. Выявлено довольно большое разнообразие аминокислотных остатков в сайтах связывания субстрата. Проанализирована предположительная локализация ЦП. Показано, что секретируемыми пищеварительными пептидазами достоверно является только один катепсин L и с высокой степенью вероятности две катепсин В-подобные пептидазы. Проведен сравнительный анализ селективности предложенных и синтезированных заявителями и коммерчески доступных субстратов ЦП с использованием коммерческих препаратов ЦП и пептидаз других классов, а также природных многокомпонентных смесей пищеварительных пептидаз личинок жуков-чернотелок. Показано, что лишь синтезированные заявителями субстраты, в отличие от коммерческих, селективны по отношению к ЦП и не гидролизуются пептидазами других классов, включая сериновые трипсиноподобные пептидазы. Из кишечника личинок T. castaneum выделена и очищена главная пищеварительная ЦП. Масс-спектрометрический анализ триптического гидролизата фермента позволил идентифицировать эту пептидазу как катепсин L NP_001164001. Именно этот катепсин L по данным нашего биоинформатического анализа был достоверно предсказан как пищеварительный. Исследована субстратная специфичность очищенного препарата фермента с использованием синтезированных в лаборатории и коммерчески доступных субстратов. Цистеиновая пептидаза NP_001164001 была экспрессирована в экспрессионной системе Pichia pastoris в виде неактивного прокатепсина L. Подобраны условия выделения и процессинга рекомбинантного профермента и получена активная ЦП – главный пищеварительный катепсин L личинок T. castaneum. Рекомбинантный фермент проявлял максимальную активность в интервале рН 5,6-6,0, а максимальную стабильность в промежутке значений рН от 5 до 7. Сравнение субстратной специфичности рекомбинантного и нативного катепсинов L T. castaneum показало, что значения удельных активностей по отношению к селективным субстратам, синтезированным заявителями, близки.