ИСТИНА

Бактерия Neisseria gonorrhoeae является патогеном человека. Поиск новых мишеней для лекарственных препаратов требует детальных знаний о контактах между биомолекулами, осуществляющихся в процессе функционирования болезнетворной бактерии. Система репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR) обеспечивает неизменность генетической информации в процессе репликации ДНК во всех организмах. Фундаментальной целью проекта является исследование координации активности белковых компонентов системы MMR при инициации репарации ДНК у прокариот, отличающихся от E. coli. Одной из важнейших задач, на решение которой направлен проект, является установление контактов между белками MutS, MutL, фактором процессивности прокариот – бета-субъединицей ДНК-полимеразы III (бета-«зажимом»), хеликазой UvrD и белком рекомбинации с экзонуклеазной функцией RecJ из N. gonorrhoeae. В качестве основного метода исследования белок-белковых взаимодействий в процессе MMR выбран современный подход, заключающийся в химической «сшивке» биомолекул в сочетании с протеолитическим расщеплением и масс-спектрометрией (XL-MS). Белки системы MMR функционируют на ДНК и характеризуются чрезвычайной конформационной вариабельностью и динамической подвижностью. Поэтому в проекте мы предлагаем усовершенствованный метод XL-MS, в котором ключевые белки системы MMR будут зафиксированы на ДНК. Для получения ковалентно связанного тройного комплекса ДНК с двумя «сшитыми» между собой белками предполагается использовать гетеробифункциональные соединения, содержащие реакционноспособные группы, взаимодействующие с остатками лизина и цистеина. Такие кросслинкеры не применялись ранее в методе XL-MS. Использование различных «сшивающих» агентов даст возможность оценить сближенность белков в составе тройного комплекса и получить информацию о его топологии. Полученная совместно с индийскими партнерами информация будет использована для создания комплексной картины событий, связанных с репарацией «мисматчей» в бактерии N. gonorrhoeae.

The bacterium Neisseria gonorrhoeae is a human pathogen. The search for new targets for drugs requires a detailed knowledge of the contacts between biomolecules occurring in the operation of pathogenic bacteria. Repair system non-canonical base pairs or "mismatch" (MMR) ensures the immutability of genetic information during DNA replication in all organisms. The fundamental aim of the project is to study the coordination of activity of protein components of the MMR system in the initiation of DNA repair in prokaryotes that differ from E. coli. The main method of the study of protein-protein interactions in the MMR process is the modern approach to chemical "crosslinking" of biomolecules in combination with proteolytic digestion and mass spectrometry (XL-MS). Proteins of the MMR system function on DNA conformation and are characterized by extreme variability and dynamic mobility. Therefore, we provide an improved method for XL-MS, in which the key proteins of the MMR system will be recorded in the DNA. To obtain a covalently bound ternary complex of DNA with two "crosslinked" together with proteins is supposed to be used heterobifunctional compounds containing reactive groups that interact with residues of lysine and cysteine. Such crosslinker not been used previously in the method of XL-MS. Obtained together with Indian partners the information will be used to create a comprehensive picture of the events associated with the repair of "mismatches" in the bacteria N. gonorrhoeae.

Получение мутантных форм белков MutS и MutL из системы репарации MMR N. gonorrhoeae с единственным остатком цистеина для фиксации на ДНК. Сравнительный анализ функциональной активности полученных мутантов с белками дикого типа. Проведение аффинной модификации одноцистеиновых мутантных форм MutS и MutL из N. gonorrhoeae с помощью реакционноспособных ДНК, несущих пиридилдисульфидную группировку. Наибольшая скорость реакции в случае одного из моноцистеиновых мутантов будет свидетельствовать о максимальной сближенности реакционноспособной группы в ДНК с данным остатком цистеина, что позволит сделать вывод о возможности использования его при получении тройного ковалентно связанного комплекса. Отработка условий выделения и подтверждения функциональной активности выделенных конъюгатов по их спосбности гидролизовать АТФ. Дизайн и синтез не используемых ранее для получения белок-белковых конъюгатов гетерофункциональных соединений, содержащих функциональные группы, взаимодействующие с остатками лизина и цистеина белка, а также третью функцию - флуоресцентную метку или молекулу биотина. Отработка условий модификации конъюгата ДНК-MutS или ДНК-MutL по остаткам лизина как коммерческими гетеробифункциональными кросслинкерами, так и предложенными в данной работе, в состав которых входят малеимидная и N-гидроксисукцинимидная группировки. Получение ковалентно связанных тройных комплексов ДНК с двумя белками в количествах, достаточных для последующих исследований, отработка условий протеолиза комплексов и масс-спектрометрического анализа полученных пептидов. Выявление белок-белковых контактов, возникающих при формировании комплексов на начальных этапах функционирования системы MMR из N. gonorrhoeae.

Научный коллектив в течение ряда лет разрабатывает подходы к изучению механизмов действия белков, образующих специфические комплексы с нуклеиновыми кислотами. В ходе исследований успешно применяются как физические, так и химические методы. Использование методов малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре, «футпринтинга», аффинной модификации белка реакционноспособными ДНК и применение бифункциональных «сшивающих» реагентов позволило развить концепцию и предложить модель функционирования системы рестрикции-модификации SsoII. Созданы уникальные реагенты на основе нуклеиновых кислот, взаимодействующие c аминокислотой белка (лизин, цистеин, аргинин), сближенной с определенным фрагментом ДНК в процессе функционирования. Разработаны эффективные способы введения химически активных групп в разные позиции углеводофосфатного остова и гетероциклических оснований нуклеиновых кислот. Предложена стратегия изучения механизма функционирования белков системы репарации MMR, их комплексов друг с другом и ДНК. Она заключается в необратимой «химической» фиксации того или иного комплекса и анализе его свойств методом FRET. Продемонстрирована возможность получения конъюгатов на примере белка MutS из E. coli, очистки его от непрореагировавших компонентов – исходного белка и ДНК-фрагмента методом анионообменной хроматографии. Показано, что белок MutS в составе полученных конъюгатов сохраняет свою активность: находясь в ковалентном комплексе с ДНК, он способен «разгибать» ДНК после добавления АТФ. Таким образом, конъюгаты MutS-ДНК могут быть использованы для исследования их взаимодействия с другими белками-партнерами системы репарации «мисматчей». Впервые выделены белки MutL, MutS и бета-«зажим» из Rhodobacter sphaeroides, и продемонстрирована их активность.