| 1 |
1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. |
Ингибиторы пептидаз из растений и грибов: роль в защите растений от патогенов и возможное применение в биотехнологии |
| Результаты этапа: В культуральной жидкости гриба Tolypocladium cylindrosporum обнаружены, а в последующем и выделены как высоко-, так и низкомолекулярные ингибиторы сериновых и цистеиновых пептидаз бромелаина, трипсина и субтилизина. Изучение субстратной специфичности препаратов ингибиторов показало, что они различаются по избирательности действия на различные пептидазы. Возможно, широкий спектр секретируемых ингибиторов с разнообразными свойствами необходим грибу для выполнения различных функций от регуляции собственных пептидаз до поддержания конкурентоспособности организма и участия в патогенезе.
Проведена трансформация растений табака сорта Самсун 4 новыми конструкциями с геном ингибитора сериновых протеиназ (ISP) из гречихи BWI-1a и несущих в качестве энхэнсера вставки фрагментов гена спидроина (белка паутины паука) в прямой и обратной ориентации. ПЦР анализ показал наличие в них трансгенной вставки. В настоящее время растения размножаются и проверяются в биотестах на устойчивость к фитопатогенам.
Исследована динамика наследования и экспрессии чужеродных генов в потомстве второго семенного поколения трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP). Подавляющее большинство (около 90%) трансгенных растений второго поколения после самоопыления сохраняли нормальный фенотип, полноценную трансгенную вставку и экспрессию целевого гена. Наличие расщепления и появление чувствительного фенотипа обусловлено химерностью исходных растений и наличием множественных вставок трансгена. Фитопатогенная активность тканей трансгенных растений табака с геном ISP из первого семенного поколения в 3-5 раз превосходила активность контрольных растений.
|
| 2 |
1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. |
Ингибиторы пептидаз из растений и грибов: роль в защите растений от патогенов и возможное применение в биотехнологии |
| Результаты этапа: Показано, что ингибитор субтилизина, выделенный из культуральной жидкости гриба Tolypocladium cylindrosporum, снижает активность пептидаз организмов, относящихся к различным таксономическим группам. Наибольший эффект ингибирования был отмечен для ферментов бактерий и насекомых, в то время как активность пептидаз трех из пяти использованных видов грибов в присутствии ингибитора не изменялась. Следует отметить, что ингибитор субтилизина из T. cylindrosporum не действовал на собственный субтилизиноподобный фермент, что указывает на участие этого ингибитора во взаимодействии с другими организмами, нежели на его участие в регуляции активности субтилизинподобной пептидазы, секретируемой этим грибом. Избирательное действие ингибитора, возможно, обусловлено различиями в химических структурах ферментов у бактерий, грибов и насекомых, но, в то же время, может указывать и на определенную роль ингибитора пептидаз из T. cylindrosporum во взаимодействиях гриба с насекомыми (преодоление иммунных барьеров хозяев) и бактериями (защите пищевых ресурсов).
Среди ингибиторов пептидаз из семян гречихи выявлен ингибитор пептидаз BWI-3c, одновременно эффективно подавляющий активности сериновых пептидаз 3 различных семейств – трипсина, химотрипсина и субтилизина, ген которого планируется в дальнейшем использовать для получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам и вредителям.
В биотестах in vitro показано, что гомогенаты тканей серии новых трансформантов растений табака, содержащих гены защитных пептидов (ингибитора сериновых протеиназ ISP из гречихи BWI-1a) и несущих в качестве энхэнсера вставки фрагментов гена спидроина (белка паутины паука), проявляли повышенную антибактериальную активность как в отношении грамотрицательных (Pseudomonas syringae, Erwinia carotovora) так и грамположительных (Clavibacter michiganensis) бактерий. Однако, увеличение количества целевых генов в трансформирующем векторе до 2 и 4 повторов не приводило к заметному увеличению защитного эффекта по сравнению с единичным геном ингибитора сериновых протеиназ ISP. В настоящее время продолжается дальнейшее формирование коллекции трансгенных растений табака с векторными конструкциями различного дизайна и изучение экспрессии гетерологичных генов в полученных коллекциях трансформантов.
|
| 3 |
1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Ингибиторы пептидаз из растений и грибов: роль в защите растений от патогенов и возможное применение в биотехнологии |
| Результаты этапа: В культуральной жидкости гриба Tolypocladium cylindrosporum обнаружены, а в последующем и выделены как высоко-, так и низкомолекулярные ингибиторы сериновых и цистеиновых пептидаз бромелаина, трипсина и субтилизина. Показано, что ингибитор субтилизина, выделенный из культуральной жидкости гриба Tolypocladium cylindrosporum, снижал активность пептидаз организмов, относящихся к различным таксономическим группам, но не действовал на собственный субтилизиноподобный фермент, что Избирательное действие ингибитора, возможно, обусловлено различиями в химических структурах ферментов у бактерий, грибов и насекомых, но, в то же время, может указывать и на определенную роль ингибитора пептидаз из T. cylindrosporum во взаимодействиях гриба с насекомыми (преодоление иммунных барьеров хозяев) и бактериями (защите пищевых ресурсов).
Среди ингибиторов пептидаз из семян гречихи выявлен ингибитор пептидаз BWI-3c, одновременно эффективно подавляющий активности сериновых пептидаз 3 различных семейств – трипсина, химотрипсина и субтилизина, ген которого планируется в дальнейшем использовать для получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам и вредителям.
Проанализированы доступные данные о структуре, механизмах действия, условиях работы и разнообразии функций ингибиторов пептидаз грибов. Отмечено, что с одной стороны, уникальные ингибиторные свойства некоторых ингибиторов могут быть использованы для избирательного ингибирования только пептидаз, важных для инициации и разития патогенного процесса. С другой стороны, широкая ингибиторная активность других ингибиторов, направленная против представителей нескольких каталитических классов пептидаз, могла бы обеспечить более эффективную защиту трансгенных растений от атаки насекомых-вредителей, преодолев компенсационное появление у этих вредителей новых пептидаз, нечувствительных к трансгенному ингибитору. Совокупность проанализированных данных указывает на то, что открытие грибных ингибиторов расширяет спектр известных ингибиторов пептидаз, которые потенциально могут быть использованы в медицинской практике и в защите сельскохозяйственных культур.
Впервые проведена трансформация растений табака сорта Самсун 4 новыми конструкциями с геном ингибитора сериновых протеиназ (ISP) из гречихи BWI-1a и несущих в качестве энхэнсера вставки фрагментов гена спидроина (белка паутины паука) в прямой и обратной ориентации. ПЦР анализ показал наличие в них трансгенной вставки. В биотестах in vitro было показано, что гомогенаты тканей этих трансформантов проявляли повышенную антибактериальную активность как в отношении грамотрицательных (Pseudomonas syringae, Erwinia carotovora) так и грамположительных (Clavibacter michiganensis) бактерий.
Показано, что трансгенные растения табака с геном ингибитора протеиназ были более устойчивы к действию грибной инфекцмии - фузариозному увяданию.
Исследована динамика наследования и экспрессии чужеродных генов в потомстве второго семенного поколения трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP). Подавляющее большинство (около 90%) трансгенных растений второго поколения после самоопыления сохраняли нормальный фенотип, полноценную трансгенную вставку и экспрессию целевого гена. Фитопатогенная активность тканей трансгенных растений табака с геном ISP из 1 и 2 семенных поколений в 1,5-2 раза превосходила активность контрольных растений.
В настоящее время продолжается дальнейшее формирование коллекции трансгенных растений табака и арабидопсиса с векторными конструкциями различного дизайна и изучение экспрессии гетерологичных генов в полученных коллекциях трансформантов.
|
