ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Данный проект был посвящен решению задачи по изучению поведения в организме ранее созданных в нашей лаборатории наноразмерных средств диагностики и терапии раковых опухолей: модульных нанотранспортёров (МНТ) – полипептидных молекул, способных адресно доставлять в раковые клетки радиоизотопы, и полиплексов – комплексов поликатионов с ДНК для генной терапии рака. В случае с МНТ было исследовано биораспределение данных белковых конструкций при различных способах введения в организм мыши. В частности, удаление His-tag из состава МНТ существенным образом не меняло профиль распределения при внутривенном введении. При этом внутриопухолевое введение МНТ, меченного 111In, приводит к его продолжительному удерживанию в экспериментальной опухоли мышиной меланомы после однократного внутриопухолевого ведения, что было установлено с помощью метода однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ). Уменьшение регистрируемой в опухоли активности подчиняется экспоненциальному закону со временем уменьшения активности в два раза равным 1,6 дня. Таким образом, длительное удерживание МНТ в опухоли за счёт его способности связываться с раковыми клетками и проникать в их ядра может быть использовано для терапии локализованных неоперабельных опухолей. Альтернативным направлением лечения злокачественных опухолей является генная терапия. Для целей доставки генов в экспериментальные опухоли меланомы были использованы полиплексы на основе блок-сополимеров полиэтиленимина (ПЭИ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) с лигандным пептидом MC1SP, специфичным к меланокортиновым рецепторам первого типа, которые, в свою очередь, сверхэкспрессированы на поверхности клеток подавляющего большинства меланом. В качестве доставляемого гена нами был выбран ген натрий-иодидного симпортёра (НИС), который может быть использован как для диагностики, так и для терапии рака. Было показано, что добавление радиоизотопа 125I спустя 24 ч после трансфекции геном симпортера с помощью полиплексов приводил к быстрому накоплению изотопа в клетках меланомы Клаудмана S91 (клон М-3). При введении в кровь полиплексы способны накапливаться в опухоли за счёт так называемого эффекта «повышенной проницаемости и удерживания», связанного с повышенной проницаемостью опухолевых сосудов, что было установлено методом прижизненной микроскопии. Вместе с тем, лишь небольшая доля от изначально накопившегося количества полиплексов проникает из сосудов в ткань на глубину до 20 мкм. При этом 60 % от этого количества выходят из сосудов в течение первых 15 минут. Сравнение накопления и кинетики выхода из сосудов контрольных и лигандированных полиплексов в опухоли не выявило существенных различий. Вместе с тем, оценка эффективности доставки гена НИС в опухоли меланомы с помощью полиплексов, проведённая с помощью ОФЭКТ, выявила в 2 раза большее накопление 123I в опухоли после введения лигандированных полиплексов, несущих ген НИС, чем при введении контрольных полиплексов. Согласно полученным данным, максимальный уровень поглощённого опухолью 123I, вызванного экспрессией гена НИС в опухоли, наблюдался спустя 24 ч после введения полиплексов с лигандом и составил 6.8 ± 1.1 % введённой дозы на грамм ткани, чего оказалось достаточно для визуализации опухоли. Наконец, было показано, что эффективность доставки генов с помощью полиплексов во многом определяется пролиферативной активностью раковых клеток. В результате, по итогам работы нами была продемонстрирована возможность применения разработанных в нашей лаборатории полиплексов для визуализации опухоли методом ОФЭКТ, что может быть использовано для клинической диагностики рака меланомы.
ООО "БиоПрогресс" | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
2 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Исследование динамики биораспределения в организме лабораторных животных наноразмерных многофункциональных средств доставки генетического материала и противоопухолевых препаратов методами мультифотонной лазерной сканирующей микроскопии и однофотонной эмис |
Результаты этапа: На клетках линии мышиной меланомы Клаудмана S-91 (клон М-3) были подобраны оптимальные условия трансфекции геном натрий-иодидного симпортѐра NIS с помощью полиплексов. Для данной цели были использованы полиплексы на основе блок-сополимеров полиэтиленимина (ПЭИ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) с лигандным пептидом MC1SP, специфичным к меланокортиновым рецепторам первого типа, которые, в свою очередь, сверхэкспрессированы на поверхности клеток подавляющего большинства меланом. В случае использования NIS в качестве доставляемого гена было показано, что добавление радиоизотопа 125I- спустя 24 ч после трансфекции геном симпортера с помощью полиплексов приводил к быстрому накоплению изотопа в клетках М-3. Использование «сильного» цитомегаловирусного CMV-промотора, под которым находился ген NIS, вызывало в 2 раза более высокий уровень накопления радиоизотопа в клетках, чем при использовании меланомоспецифичного MIA-промотора. Измеренный по поглощению 125I- максимум экспрессии симпортѐра в клетках при трансфекции полиплексами соответствовал 48-72 ч. Была разработана модель с экспериментальными опухолями меланомы мыши с постоянной экспрессией гена NIS в клетках меланомы Клаудмана S-91 (клон М-3). На данной модели были подобраны условия проведения экспериментов для визуализации NIS-экспрессирующей опухоли с использованием метода однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) на приборе USPECT-II/CT (MiLabs, Голландия). Согласно полученным результатам, спустя 90 мин после введения радиоизотопа 123I- (18,5 МБк) кинетика накопления выходит на плато и удерживается как минимум до 3 часов. Уровень захвата иодида в опухоли, наблюдаемый на меланоме М-3 NIS, стабильно трансфицированной геном NIS, составил 24,3 ± 3,5 % введѐнной дозы на грамм ткани. Как показала обработка реконструированных 3D проекций, достигнутого уровня поглощения радиоизотопа 123I- оказалось достаточно, чтобы визуализировать опухоль. Кроме того, накопление иодида наблюдалось также в мочевом пузыре и в органах с естественной экспрессией NIS (в частности, в щитовидной железе, желудке, слюнных железах). Внутрибрюшинное ведение ингибитора NIS перхлората в количестве 2 мг за полчаса до начала съемки, приводило к отсутствию накопления 123I- в опухоли. На основе ранее отлаженного метода постановки накожных камер были подобраны условия съѐмки полиплексов в опухоли и в нормальной подкожной ткани, а также разработана схема проведения подобного рода экспериментов и способ обработки результатов для получения количественных характеристик. С этой целью были использованы полиплексы, ДНК в составе которых была флуоресцентно помечена квантовыми точками QD605. Для выявления сосудов мышам предварительно (за 2 минуты до введения полиплексов в дозе 80 мкг ДНК на животное) вводили внутривенно 0,4 мг FITC-декстрана, 150 кД. Съѐмку выбранного участка опухоли М-3, либо подкожной соединительной ткани, используя режим оптических срезов Z-stack на мультифотонном лазерном сканирующем микроскопе (не менее 12 оптических срезов с шагом в 8 мкм), проводили через 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 и 240 минут после введения полиплексов. До введения полиплексов предварительно проводили съемку выбранного участка для последующего вычитания уровня автофлуоресценции в процессе количественного анализа, который проводили с помощью программы Image-Pro PLUS 5.0. Разработанные схемы способов обработки изображений позволят оценить время циркуляции полиплексов в крови, кинетики изменения их концентрации в ткани опухоли и в подкожной соединительной ткани, а также кинетику выхода полиплексов из сосудов и их диффузии в ткани опухоли или в нормальной подкожной ткани. | ||
3 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Исследование динамики биораспределения в организме лабораторных животных наноразмерных многофункциональных средств доставки генетического материала и противоопухолевых препаратов методами мультифотонной лазерной сканирующей микроскопии и однофотонной эмис |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".