| Результаты этапа: Сборка вириона является одним из основных этапов инфекционного цикла вирусов различной природы. Однако, несмотря на это, механизмы сборки, сигналы или необходимые структурные элементы, влияющие на упаковку вирусного генетического материала в вирион, у вирусов растений со спиральной структурой до сих пор мало изучены. На первом этапе выполнения проекта было показано, что присутствие кэп-структуры на 5'-конце нуклеиновой кислоты играет важную роль при образовании вирусных рибонуклеопротеидов с участием белка оболочки Х вируса картофеля (ХВК). Мы предположили, что кэпирование оказывает влияние на вторичную структуру 5'-конца молекулы и приводит к формированию конформационного сигнала упаковки вирусной РНК с образованием вирусных рибонуклеопротеидов (вРНП). В этом году получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что кэп-структура может быть удалена с предварительно кэпированной молекулы РНК, и это не влияет на возможность и эффективность сборки вРНП. С помощью кислой пирофосфатазы табака кэп-структура была удалена с предварительно кэпированных 5’-концевых транскриптов потексвирусов. Декэпированные транскрипты были проинкубированы с белком оболочки (БО) ХВК, и образование вРНП было зафиксировано с помощью трансмиссивной электронной (ТЕМ) и атомно-силовой (AFM) микроскопий. Полученые данные являются доказательством того, что кэп-структура сама по себе не является фактором, необходимым для взаимодействия РНК с БО ХВК при формировании вРНП, или сигналом для инициации сборки вРНП. Однако, по-видимому, конформационное состояние 5'-конца молекулы, возникающее при кэпировании РНК, является крайне стабильным, и после удаления кэп-структуры конформационный сигнал упаковки, необходимый для сборки вРНП, не изменяется. С помощью метода анализа траектории частиц (nanoparticle tracking analysis – NTA) впервые удалось количественно оценить эффективность образования вРНП при инкубации БО ХВК с геномными РНК, относящимися к различным таксономическим группам, декэпированной геномной РНК, кэпированными и декэпированными 5’-концевыми транскриптами РНК потексвирусов. Получены вирусоподобные частицы (ВПЧ) вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт) in situ при суперэкспрессии БО ВМАльт в растениях с помощью деконструированного вируса-вектора, полученного на основе кДНК ВМАльт. Проведена сравнительная характеристика ВПЧ ВМАльт, полученных in situ, ВПЧ ВМАльт, полученных in vitro из БО выделенного из очищенных вирионов и нативных вирионов ВМАльт с помощью AFM, ТЕМ и трипсинового теста. Показано, что морфология, размеры и укладка белковой спирали ВПЧ, полученных при суперэкспрессии БО ВМАльт в растениях (in situ), идентична ВПЧ, полученным in vitro. |
