![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Проект имеет отношение к биологии рака и посвящен изучению механизмов реорганизации хроматина с участием поли(АДФ-рибоза)полимеразы 1 (PARP-1) человека. Поли-АДФ-рибозилирование, осуществляемое PARP-1, является посттрансляционной модификацией, ассоциированной с репарацией ДНК, регуляцией транскрипции и апоптоза. PARP-1 участвует в злокачественной трансформации и необходим для развития ряда опухолей, гиперэкспрессирован во многих типах агрессивных видов рака и является признанной мишенью для противоопухолевых препаратов. Механизмы реорганизации хроматина с участием PARP-1 остаются малоизученными и требуют систематического исследования. Используя имеющийся научный задел и успешный опыт многолетнего сотрудничества российских и американских научных групп, в проекте планируется рассмотреть четыре основных вопроса. (1) Каковы структурные изменения, вызываемые связыванием PARP-1 с нуклеосомой? (2) Как PARP-1 влияет на связывание линкерных гистонов нуклеосом? (3) Как PARP-1 влияет на структуру и стабильность интермедиатов элонгации транскрипции? (4) Как эти различные активности PARP-1 механистически связаны друг с другом?
This collaborative proposal addresses mechanisms of chromatin reorganization by human poly(ADPribose) polymerase 1 (PARP-1). PARP-1 is a multifunctional player in cell metabolism. It is involved in malignant transformation and tumor survival, and is overexpressed in many different aggressive cancers; it is a recognized target for anticancer drugs and therapies. Poly(ADP-ribosyl)ation of proteins is a posttranslational modification associated with DNA repair, transcriptional regulation and apoptosis. Different models explaining the role of PARP-1 in chromatin reorganization during these processes have been proposed; however, they require further systematic evaluation, since underlying mechanisms remain poorly understood. We propose to address four primary questions: (1) What are the structural changes induced by PARP-1 binding to nucleosomes? (2) How is the binding of linker histones to nucleosome affected by PARP-1? (3) How does PARP-1 affect the structure and stability of transcript elongation intermediates? (4) Are the different PARP-1 activities mechanistically related to each other?
В результате выполнения проекта будут разработаны модели взаимодействий PARP-1 (и его мутантов) с нуклеосомами на разных стадиях ферментативной автомодификации этого белка и связанных с этим структурных перестроек нуклеосом, структурных особенностей PARP-1-нуклеосомных комплексов в присутствии противоопухолевых соединений, а также PARP-1-индуцированных изменений структуры интермедиатов, которые образуются при транскрипции. Углубленное механистическое понимание взаимодействия PARP-1 с хроматином приведет к идентификации новых потенциальных мишеней (интерфейсов и интермедиатов взаимодействия) и заложит основу для направленной разработки более мощных и специфических PARP-1-нацеленных противораковых препаратов.
Цели и задачи этого проекта будут достигаться благодаря существенному научному заделу, созданному в процессе развивающегося более 5 лет сотрудничества российских и американских партнеров. Этот задел включает в себя предварительные результаты, демонстрирующие применимость современных экспериментальных методов (время-разрешенных биохимических подходов, изучения кинетики переходных состояний, spFRET-микроскопии, молекулярного моделирования) совместно с избранными биохимическими и молекулярно-генетическими подходами для изучения взаимодействий фактора PARP-1 и PARP-1-зависимой транскрипции.
Fox Chase Cancer Center | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 11 августа 2017 г.-8 августа 2018 г. | Механизм взаимодействия PARP-1 с хроматином |
Результаты этапа: На первом этапе проекта для исследований структурных перестроек внутри коровой части ДНК и в линкерной ДНК на основе нуклеосом-позиционирующей последовательности 603 были получены три типа флуоресцентно-меченых мононуклеосом с несколькими вариантами расположения меток: кор-нуклеосомы (CN), у которых отсутствуют линкеры; нуклеосомы с одним линкерным участком длиной 20 п.н. (LN) и нуклеосомы с двумя линкерными участками длиной 40 п.н. (2LN). Концы линкерной ДНК, расположенные вне кор-нуклеосомы, служили в качестве двухцепоченых разрывов, сенсором которых является PARP-1. СN и LN использовали для изучения PARP1-индуцированных структурных изменений в коровой области нуклеосом в зависимости от положения двуцепочечного обрыва ДНК. 2LN использовали для изучения влияния PARP1 на структуру линкерной ДНК. В случае СN и LN обнаружено концентрационно-зависимое образование комплексов нуклеосом с одной, двумя и тремя молекулами PARP-1. Обнаружены и детально исследованы кинетические и концентрационно-зависимые изменения в структуре CN- и LN-нуклеосом, вызываемые PARP1. Установлено, что при взаимодействии CN-нуклеосом с PARP-1 происходят структурные перестройки в областях входа/выхода ДНК из кор-нуклеосомы, которые при повышенных концентрациях фермента распространяются и на центральную область нуклеосомной ДНК. Биологическое значение подобной хроматин-моделирующей активности PARP-1, по-видимому, заключается в том, что PARP-1, как сенсор ДНК-повреждений, не только рекрутирует ферменты репарации к месту разрыва, но и облегчает им доступ к ДНК в коровой части нуклеосомы, изменяя укладку ДНК на октамере гистонов. Наличие линкера в LN усиливает подвижность (амплитуду «дыхания») ДНК вблизи входа в нуклеосому, увеличивая расстояние между соседними витками нуклеосомной ДНК в проксимальной области. Воздействие PARP-1 на структуру коровой области LN- и CN- нуклеосом значительно отличается. Образование комплекса со стехиометрией 1:1 не влияет на структуру коровой области LN, т.к. при связывании с концом линкера фермент оказывается в отдалении от коровой области. При повышении концентрации фермента обнаружено изменение структуры LN, которое происходит после связывания второй молекулы PARP-1. Обнаружено, что при низком уровне поли-АДФ-рибозилирования PARP-1 в комплексах с CN-нуклеосомами происходит ограничение взаимной подвижности соседних витков ДНК в кор-нуклеосоме. Для субпопуляции нуклеосом, в которых PARP-1 не изменил структуру, после внесения НАД+ происходит более плотная упаковка соседних витков ДНК на гистоновом коре. В ходе дальнейшего поли-АДФ-рибозилирования на молекулах PARP-1 накапливается отрицательный заряд, усиливающий отталкивание ДНК-связывающих доменов фермента от отрицательно заряженной ДНК и приводящий в итоге к диссоциации комплекса нуклеосомы с PARP-1. Эти процессы сопровождаются восстановлением исходной структуры в коровой области нуклеосомы с небольшими изменениями, вызванными, возможно, частичным поли-АДФ-рибозилированием коровых гистонов. При исследовании 2LN установлено, что PARP-1 ограничивает конформационную подвижность и структурирует линкеры, увеличивая расстояние между ними вблизи коровой области нуклеосомы и уменьшая его в области 25 п.н. до входа ДНК в нуклеосому. Предположительно структурирующий эффект PARP-1 вблизи обрыва ДНК в области линкеров помогает избежать топологических проблем, связанных с раскручиванием «оборванной» линкерной ДНК и способствует репарации таких разрывов с сохранением нативной структуры хроматина. После поли-АДФ-рибозилирования PARP-1 линкеры 2LN-нуклеосом оказываются фиксированными на расстоянии не более 10 нанометров друг от друга в области до 25 п.н. от входа/выхода ДНК из нуклеосомы. Удержание линкеров в сближенном состоянии даже после диссоциации авто-поли-АДФ-рибозилированного PARP-1 может способствовать ускоренной репарации двуцепочечного разрыва ДНК факторами репарации и восстановлению нативной структуры хроматина. Российская группа оказывала содействие в изучении американскими исследователями влияния PARP1 на транскрипцию в хроматине. Подтверждено, что PARP1 облегчает транскрипцию в хроматине. Для обеспечения эффекта требуется ферментативная активность PARP1. PARP1 облегчает транскрипционно-зависимое удаление гистонов с ДНК. Исследование кинетических стадий во время транскрипции нуклеосомной ДНК в присутствии PARP1 показало, что фермент в первую очередь влияет на наиболее «открытые» промежуточные состояния (где ДНК частично и временно откручивается от тетрамера H3/H4). Данные позволяют предположить, что отрицательно заряженный поли-АДФ-рибозилированный PARP1 взаимодействует с временно экспонированной положительно заряженной поверхностью гистонового октамера, что облегчает транскрипцию хроматина. Полученные результаты, подтверждают гипотезу о хроматин-моделирующей активности PARP-1 во время процессов репарации и транскрипции. Полученные данные служат существенным заделом для развития дальнейших, более детальных исследований механизмов действия PARP-1 на хроматин и понимания его роли в развитии патологических процессов, включая старение клеток и их онкотрансформацию. | ||
2 | 15 октября 2018 г.-3 октября 2019 г. | Механизм взаимодействия PARP-1 с хроматином |
Результаты этапа: Для исследований структурных перестроек внутри коровой части ДНК и в линкерной ДНК на основе нуклеосом-позиционирующей последовательности 603 получены три типа флуоресцентно-меченых мононуклеосом с несколькими вариантами расположения меток: кор-нуклеосомы (CN), у которых отсутствуют линкеры; нуклеосомы с одним линкерным участком длиной 20 п.н. (LN) и нуклеосомы с двумя линкерными участками длиной 20 или 40 п.н. (2LN). Концы линкерной ДНК, расположенные вне кор-нуклеосом, служили в качестве двуцепоченых разрывов, сенсором которых является PARP-1. СN и LN использовали для изучения PARP1-индуцированных структурных изменений в коровой области нуклеосом в зависимости от положения двуцепочечного разрыва ДНК. 2LN использовали для изучения влияния PARP1 на структуру линкерной ДНК. Для исключения взаимодействия PARP-1 с двуцепочечными разрывами концы ДНК в 2LN маскировали шпильками. Установлено, что при взаимодействии с СN-нуклеосомами PARP-1 может образовывать два типа комплексов. При появлении одного (LN) или двух (2LN) линкеров (т.е. при удалении концов ДНК от коровой области) PARP-1 формирует три типа комплексов. Доказано, что во все типы комплексов входит лишь одна нуклеосома, а отличаются они по количеству молекул PARP-1, связавшихся с нуклеосомой: 1:1, 1:2, 1:3. Охарактеризовано влияние PARP-1 на структуру ДНК в линкерной области нуклеосом. Установлено, что образование комплексов PARP-1 с CN, LN и 2LN вызывает структурные перестройки в коровой области нуклеосомы, указывающие на увеличение расстояния между соседними витками ДНК на октамере гистонов вблизи входа и выхода ДНК из нуклеосомы и в ее серединной области. Во всех случаях двум типам комплексов соответствует связывание молекул PARP-1 с концами («разрывами») ДНК, а при увеличении расстояния между «разрывами» ДНК и коровой частью нуклеосомы возникает возможность связывания третьей молекулы PARP-1 с коровой областью. По результатам анализа сделан вывод, что именно взаимодействие PARP-1 с кор-нуклеосомами существенным образом влияет на изменение структуры нуклеосомы. Установлено, что введение шпилек по концам ДНК на расстоянии 20 п.н. от коровой области (маскирование двуцепочечных разрывов ДНК) не ослабляет взаимодействия нуклеосом с PARP1, а фермент сохраняет свою способность изменять структуру нуклеосом в наномолярном диапазоне концентраций. Открытые нами PARP1-опосредованные изменения в структуре нуклеосом важны, поскольку они предположительно способствуют деконденсации хроматина и облегчают доступ ферментов репарации к повреждениям ДНК. В отсутствии повреждений ДНК структурные изменения, вызываемые PARP1 в нуклеосомах, могут быть существенным элементом молекулярных механизмов, лежащих в основе сигнальной и регуляторной функций фермента. Полученные данные проясняют структурные аспекты хроматин-модулирующего действия PARP-1, которое, как впервые показали наши исследования, может происходить и в отсутствии поли-АДФ-рибозилирования. При поли(АДФ)рибозилировании происходит диссоциация PARP-1 и образование свободных нуклеосом. Установлено, что при добавлении NAD+ к комплексам LN-PARP-1 происходят концентрационно-зависимые структурные изменения, которые указывают на почти полное восстановление исходной структуры свободных нуклеосом, как вблизи входа и выхода ДНК из нуклеосомы, так и в ее серединной части. Полного восстановления укладки ДНК на октамере гистонов при этом не происходит, вероятного, из-за частичного поли(АДФ)рибозилирования гистонов. Установлено, что PARP1-опосредованное АДФ-рибозилирование гистонов происходит не только в мононуклеосомах, но и в препаратах полинуклеосом различной длины, полученных в результате частичного расщепления препарата хроматина микрококковой нуклеазой. Установлено, что автополи(АДФ)рибозилирование PARP1 происходит сходным образом и со сходной эффективностью вне зависимости от структуры линкерной области нуклеосом, а концы коровых гистонов существенно не влияют на эффективность автополи(АДФ)рибозилирования PARP1 в комплексе с нуклеосомами. Начато изучение особенностей комплексообразования и поли(АДФ)рибозилирования в составе комплексов с мутантными формами PARP-1: E988K, L713F, W318R, L248D/W350D и с удаленным BRCT- доменом. Исследования показали, spFRET микроскопия позволяет получать новые важные данные об особенностях взаимодействия с нуклеосомами мутантных форма PARP-1. На следующем этапе эти исследования будут продолжены в расширенном варианте и дополнены данными биохимических методов исследований. Показано, что spFRET-анализ в нуклеосомной системе позволяет анализировать как каталитическое, так и структурное воздействие ингибиторов PARP-1. Ведется изучение влияния ингибиторов PARP-1 олапариба и госсипола на структурные особенности комплексов нуклеосом с PARP-1 и их поли-АДФ-рибозилирование. | ||
3 | 29 ноября 2019 г.-27 ноября 2020 г. | Механизм взаимодействия PARP-1 с хроматином |
Результаты этапа: В исследованиях третьего года были получены новые данных о роли разных доменов PARP-1 в хроматин-модулирующей и транскрипционной активностях. Охарактеризованы особенности взаимодействия мутантных форм PARP-1 с нуклеосомами и получены данные, проясняющие структурно-функциональную роль отдельных доменов PARP-1 в ремоделировании хроматина. Эти данные были получены для: 1) PARP-1 с мутациями в домене Zn3 (мутант W318R и мутант L248D, W350D), 2) PARP-1 с делетированным BRCT доменом (Δ367-494), 3) E988K мутантной формы PARP-1 с ослабленной каталитической активностью, а также 4) гиперактивного мутанта L713F. С использованием мутантных и нативной форм PARP-1 получены данные о взаимодействиях ингибиторов PARP-1 олапариба и госсипола с комплексами нуклеосома-PARP-1; об их воздействии на структуру нуклеосом в присутствии и отсутствии фермента; об их влиянии на НАД+- индуцированное автоПАРилирование и структурные изменения в нуклеосомах. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".