ИСТИНА

В молекулярной биологии и генетической инженерии всё чаще возникает потребность в никующих эндонуклеазах (НЭ) - сайт-специфических ферментах, вносящих разрыв в определенное положение только одной из цепей в двуспиральной ДНК. Современные возможности рационального дизайна белков открывают широкие перспективы конструирования НЭ с заданными свойствами, направленного изменения специфичности и модулирования их активности. Однако особенности функционирования этих ферментов остаются практически неизученными. Задачей проекта является детальное изучение механизма связывания и гидролиза ДНК-субстрата никующей эндонуклеазой BspD6I с целью использования этого фермента в «хирургии» генома. Планируется детально охарактеризовать стадии взаимодействия НЭ BspD6I с ДНК, предложить схему функционирования фермента, выявить аминокислотные остатки белка и группы атомов в ДНК, вовлеченные в связывание и катализ гидролиза субстрата. В рамках проекта будет продолжена разработка подходов для регулирования каталитической функции НЭ BspD6I при облучении светом определенной длины волны или незначительном изменении температурного режима. НЭ BspD6I является большой субъединицей гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции (ЭР) BspD6I. Характер взаимодействия НЭ BspD6I со второй, малой субъединицей ЭР BspD6I в составе гетеродимерной ЭР BspD6I, а также малой субъединицы с ДНК является одним из ключевых вопросов данного проекта. Для его решения будут использованы методы «кросслинкинга» белок-белковых и белково-нуклеиновых комплексов, а также изучены свойства специально полученных мутантных форм НЭ BspD6I. Направленное и обратимое выключение и включение каталитической функции малой субъединицы ЭР BspD6I «заставит» гетеродимерный фермент совершать один или два разрыва в ДНК в зависимости от целей исследования. Важнейшей задачей проекта является конструирование высокоспецифичных химерных эндонуклеаз для геномной терапии. С этой целью будет осуществлен тщательный подбор аминокислотной последовательности и длины линкера, соединяющего ДНК-связывающий (с TALE-повторами) и ДНК-гидролизующий домены. Предполагается использование НЭ BspD6I и ЭР HinP1I с контролируемой гидролитической активностью в качестве гидролизующих модулей в составе химерных нуклеаз.

Выделение субъединиц эндонуклеазы рестрикции: большой - НЭ BspD6I и МС BspD6I. Определение кинетических параметров связывания НЭ BspD6I с субстратом (с помощью метода акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре), а также термодинамических характеристик процесса связывания НЭ BspD6I с субстратом (методом «торможения» в геле в неденатурирующих условиях). Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 6-метил-2'-дезоксиаденозин в участке узнавания НЭ BspD6I, анализ связывания НЭ BspD6I с монометилированными ДНК.Определение участка ДНК, вовлеченного во взаимодействие с НЭ BspD6I и ЭР BspD6I, методом «отпечатков» с участием дезоксирибонуклеазы I.Синтез олигодезоксирибонуклеотидов различной длины, немодифицированных и содержащих 1, 2 и 3 азобензольные вставки. Конструирование ДНК-систем для развития подхода «молекулярная ловушка». Оценка термической устойчивости составного немодифицированного и азобензолсодержащих дуплексов, подбор условий для временного блокирования активности НЭ BspD6I в присутствии азобензолсодержащего дуплекса (подход «молекулярная ловушка»).Подбор условий модификации НЭ BspD6I и МС BspD6I с помощью 2-нитробензилбромида, проверка способности модифицированных белков связывать и гидролизовать субстрат.