ИСТИНА

Изучение регуляции цитохромоксидазы, осуществляемой посредством связывания с ней низкомолекулярных эффекторов: 1. через Центр Связывания Катионов (ЦСК), взаимодействующий с высокой специфичностью с ионами Ca2+ и Na+. Показано, что Са ингибирует перенос электронок с гема а на гем а3, а также восстановление гема а. 2. через недавно обнаруженное место связывания амфипатических и умеренно гидрофобных лигандов вблизи устья протонного канала К, доставляющего в каталитический центр «субстратные» протоны для образования воды из кислорода. В качестве таких лигандов использованы Тритон Х-100 (ЕЧ) и деоксихолат (ДОХ). Показано, что ТХ и ДОХ эффективно ингибируют общую активность ЦО (дыхание), но не действуют на частную пероксидазную активность фермента. 3. через расположенные по обе стороны мембраны входы и выходы каналов, осуществляющих трансмембранный перенос H+ протонным насосом ЦО, которые взаимодействуют с ионами цинка, меди и других многозарядных металлов. 4.через сам каталитический гем-медный центр восстановления кислорода. Хотя этот центр расположен глубоко внутри молекулы ЦО, в него проникают через специальный гидрофобный канал как естественный субстрат, кислород, так и молекулы других лигандов. Показано, что к таким лигандам относится аммиак, часто используемый для выделения фермента с помощью высаливания в сульфате аммония. Аммиаквызывает сдвиг полосы поглощения гема, ингибирует дыхание и замедляет связывание других лигандов, цианида и перекиси, что объясняет наблюдаемый сдвиг равновесия между интермедиатами Р и F в пользу Р.

Studies on the regulation of cytochrome c oxidase (CcO) by low molecular effectors 1. via cation binding center (CBC) which binds with high affinity ions of Ca2+ or Na+ . It has been shown that C2+ inhibits electron transfer between hemes a and a3 and also reduction of heme a. 2. via a conserved amphipathic ligand binding region defined recently in the 3-D structure of catalytic subunit I of CcO located near the entrance of K- proton channel which deliver “substrate” protons for water formation to binuclear center. Triton X-100 (TX) and desoxycholate (DOC) were used as such ligands. TX and DOC appeared to be effective inhibitors of the overall oxidase activity (respiration) while did not affect at all peroxidase reaction catalyzed by the enzyme. 3. via entrance and exit parts of proton channels located on the opposite sites of the membrane wich interacts with Zn, Cu and other multivalent cations. 4. via binuclear heme-copper center of oxygen reduction. Binuclear center is deeply buried in the protein core but oxygen and other ligands can penetrate to it via a special hydrophobic channel. It has been shown that ammonia belongs to the family of CcO ligands. Its binding to binuclear center results in a spectral shift, inhibition of respiration and decrease the rate of interaction of other ligands such as KCN, H2O2 with CcO which explains the effect of steady-state shift of equilibrium between P and F intermediates in favour of P in the presence of ammonia observed by Michel’s group.

Планируется продолжить и развить исследования амфипатической площадки ЦО.Наша рабочая гипотеза состоит в том, что и в ЦО из сердечной мышцы присутствует такой центр, и что молекулы таких детергентов, как Тритон и ДОХ могут при связывании с этим центром перекрывать протонный канал К, вызывая тем самым ингибирование работы фермента, аналогичное действию мутаций К362M или К354 в К-канале фермента из R. sphaeroides и P. denitrificans.

Получены первые результаты по действию амфипатических лигандов Тритона Х-100 и деоксихолата на выделенную ЦО. Отработан метод регистрации пероксидазной активности ЦО.

Суммированы новые результаты по изучению КСЦ. Пересмотрены данные о специфичности сайта к разным катионам, описана зависимость ингибирующего эффекта Са от скорости работы ЦО, обнаружено повышенное сродстве Са к так называемой "медленной" форме ЦО.показано, что ингибирующее действие ионов Са на митохондриальную ЦО определяется торможением переноса электронов как между двумя гемами а и а3, так и поступлением их на гем а и свидетельствует, что перенос электронов через гем а в митохондриальной ЦО может быть сопряжен с движением протонов в выходной части канала H. Были начаты важные эксперименты по изучению связывания лигандов с амфипатической площадкой, обнаруженной в структуре каталитической субъединицы 1 ЦО. Полученные данные, свидетельствуют, что действие лигандов амфипатической площадки в субъединице 1 ЦО может объясняться нарушением работы протонного канала К, т.е. представляет собой довольно специфическим эффект. Таким образом, регуляция работы фермента может эффективно осуществляться путем избирательного подавления самой первой стадии реакции: восстановления кислорода до H2O2, требующей участия канала К. С большой вероятностью, аналогичным действием на ЦО могут обладать стероидные гормоны, желчные пигменты и многие другие физиологически активные соединения сходной структуры в животной клетке, что представляет большой интерес для понимания регуляции работы ЦО в клетке и фармакологии. Показано, что аммиак в мМ диапазоне концентраций связывается с активным центром ЦО, тормозит ее активность и замедляет взаимодействие с активным центром других лигандов, что объясняет эффект сдвига равновесия между интермедиатами Р и F.