Инновационные подходы к новому поколению цианиновых красителей медицинского назначенияНИР

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 июня 2014 г.-31 декабря 2014 г. Инновационные подходы к новому поколению цианиновых красителей медицинского назначения
Результаты этапа: Установлен механизм комплексообразования красителя индоцианинового зеленого (ICG) с альбумином и исследованы спектрально-кинетические характеристики быстрых стадий этого процесса. Образование двух нековалентных комплексов HSA-ICG впервые подтверждено кинетическими экспериментами на установке остановленной струи. Определены характеристические константы скорости s-цис–транс изомеризации полиметиновой цепи красителя непосредственно в центрах связывания I и II молекулы альбумина. Показано, что изомеризация быстрее происходит в более объемном центре I, расположенном в субдомене IIА: красители в комплексах принимают энергетически более выгодную s-транс-конфигурацию. Методом импульсного фотолиза были исследованы фотохимические процессы при фотовозбуждении красителя ICG в растворах. Квантовый выход триплетного со стояния ICG в обескислороженном растворе изопропанола был чрезвычайно низким и оценивается нами Т  1× 10-5. Впервые разработан препаративный синтез ранее неописанных аналогов кардиогрина с фосфонатными группами, обладающих нужными спектральными характеристиками, и одновременно исключительно высокой растворимостью в воде, превышающей на порядок растворимость кардиогрина. Таким образом двумя различными прямыми кинетическими методами подтверждено образование двух комплексов для ранее неизвестных индотрикарбоцианинов с альбумином, которые обладают высоким квантовым выходом флуоресценции и могут быть потенциально фотосенсибилизаторами в медицинских исследованиях. Таким образом двумя различными прямыми кинетическими методами подтверждено образование двух комплексов для ранее неизвестных фосфоноиндотрикарбоцианинов с альбумином, которые обладают высоким квантовым выходом флуоресценции и могут быть потенциально фотосенсибилизаторами в медицинских исследованиях
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Инновационные подходы к новому поколению цианиновых красителей медицинского назначения
Результаты этапа: Таким образом, был создан и масштабирован протокол синтеза и синтезированы новые трикарбоцианиновые красители 2–3 с удаленными фосфор-содержащими группами в 3,3’-положениях у атомов азота. Для красителей 2 и 3 были определены константы связывания с человеческим и бычьим сывороточными альбуминами. Показано, что вклад кулоновского взаимодействие играет незначительную роль в образовании комплексов между альбумином и красителями, а комплексообразование определяется взаимодействием полиметиновой цепи с белком. Доказано образование двух типов комплексов между исследуемыми красителями и белками. Один из этих комплексов с более долгим временем жизни флуоресценции является комплексом молекулярной формы красителя с белком, а второй комплекс с более коротким временем жизни флуоресценции является комплексом агрегатов красителя с белком. Возрастание времени жизни возбужденного состояния в первом комплексе указывает на образование более жесткой структуры красителя.
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Инновационные подходы к новому поколению цианиновых красителей медицинского назначения
Результаты этапа: I. Синтез новых флуорофоров с двумя хромофорами в молекуле. 1. Основным фундаментальным достижением этапа 2016 года является разработка методологии синтеза новых флуорофоров с двумя хромофорами с сульфо- и фосфонатными группами. В качестве удобного синтона была удачно использована базовая структура бензодипирроленина. Направленное изменение спектральных характеристик и прочих физико-химических свойств достигается за счет варьирования заместителей у четвертичного атома азота с целью изучения влияния комбинации разных заместителей на растворимость, термо- и фотостабильность данного класса соединений. 2. Разработаны два возможных подхода к сборке бисхромофоров на основе замещенного бензодипирроленина (Схема 5, 6): конденсация симметричного бисальдегида с двумя эквивалентами четвертичной гетероциклической аммониевой соли или конденсация бензодипирролениниевых солей) с альдегидами, синтезированными формилированием депротонированных форм соответствующих индолениниевых солей. Оба подхода были нами доведены до уровня удобных метод синтеза с очисткой ряда новых бихромофорных водорастворимых индокарбоцианиновых красителей. Выбор между двумя подходами определяется в зависимости от комбинации гидрофильных и гидрофобных заместителей при четвертичном атоме азота. Мы установили, что синтоны, содержащие гидрофильные группы препаративно удобно использовать в качестве метиленовой компоненты, а фрагмент, содержащий гидрофобные заместители – в качестве карбонильной. При формилировании депротонированных форм солей по методу Вильсмайера-Хаака выделение альдегидов предполагает щелочное разложение в водной среде. Если соответствующие альдегиды содержат гидрофильную группу, выделение из водного раствора происходит с очень низким выходом. Поэтому при сочетании в молекуле бисхромофора гидрофильных и гидрофобных групп, в качестве карбонильной компоненты следует выбирать фрагмент с гидрофобным заместителем. 3. В результате проведенного исследования нами был осуществлен синтез серии бензодипирролениниевых солей алкилированием бензодипирроленина галоидалканами с различной длиной углеводородной цепи. Показано, что удлинение цепи приводит к снижению выхода. Были подобраны условия алкилирования п-фенилендиамина 2-бром-2-метилбутаноном, при этом оптимизированы условия синтеза и выделения продукта алкилирования. Далее мы подобрали условия циклизации пиролизом гидрохлорида с образованием именно нужного нам бензодипирроленина 1 без примеси второго возможного изомера. Следует отметить, что этот факт является принципиальным моментом синтеза. Введение гидрофильных групп в бензодипирроленин было осуществлено алкилированием последнего бутансультоном для введения сульфогруппы, бромпроизводными кислот и эфиров кислот для введения карбоксильных групп. Далее были получены конформационно закрепленные сульфо- и фосфонатные аналоги, отработаны методики, получены модельные соединения и проведена. модификация структур (см. Схему 5, 6). Синтезирована новая серия бихромофоров, содержащих как гидрофильные, так и липофильные группы. 4. Спектрально-кинетических характеристики новых бисфлуорофоров. При объединении в одну молекулу двух сопряженных хромофоров в результате диполь-дипольного взаимодействия происходит расщепление возбужденного синглетного уровня на два новых уровня и в спектрах поглощения наблюдается две новых полосы, одна из которых имеет сдвиг в. длинноволновую область по сравнению с полосой поглощения материнской молекулы и исследованы. Получены значения константы комплексообразования бискарбоцианина с альбумином,определен квантовый выход флуоресценции, измерены времена жизни флуоресценции комплексов бискарбоцианина с альбумином в нано- и пико-секундном диапазонах τ1 = 220 пс и τ2 =980 пс. В экспериментах по Т-Т переносу энергии от антрацена на молекулы красителя фотолиза получены спектры поглощения синтезированных бискарбоцианиновых красителей. Установлено, что заселение триплетных уровней бискарбоцианинов происходит только в фотосенсибилизированном процессе. Также не было обнаружено синглетного кислорода при прямом фотовозбуждении красителей и их комплексов с белками крови (альбуминв, липопротеины низкой плотности) при регистрации люминисценции при 1270 нм. Синтезированные в данном проекте фосфонатзамещенные карбоцианиновые красители и бискарбоцианиновые красители могут быть использованы как флуоресцентные зонды в биологии и медицине благодаря высоким коэффициентам экстинкции и интенсивной флуоресценции в видимой и ближней инфракрасной области спектра, минимальному повреждению биологических образцов in vivo и одновременно глубокому проникновению в ткани. II. Важнейшие свойства новых фосфонатзамещенных флуорофоров. В 2016 году были продолжены работы по изучению свойств новых фосфонатзамещенных флуорофоров. В предыдущем отчете мы сообщали о синтезе новых фосфонатзамещенных карбоцианинов с рекордной водорастворимостью в воде для использования in vivo. Эта часть работы была продолжена в плане оптимизации синтетических протоколов и особенно в плане наработки образцов двух серий с -P(O)(OR)2 и P(O)(OH)2 – группами и однозначной идентификации новых флуорофоров. Последние плохо поддаются идентификации с помощью 1Н-ЯМР-спектров, так как из-за образования различных агрегатов спектры представляют собой плохо разрешенные мультиплеты. При регистрации спектров ЯМР 31Р в CD3OD при более низкой концентрации целевого вещества наблюдается только один сигнал атома фосфора в области δ 29—32 м.д., что полностью соответствует величине хим.сдвига фосфонатной группы. Два типа агрегатов - H-агрегаты и J-агрегаты- хорошо фиксируются в электронных спектрах поглощения. Показано, что агрегированные и неагрегированные формы существуют в растворе в равнове Анализ масс-спектров высокого разрешения показал, что флуорофоры с -P(O)(OR)2 – группой регистрируются в виде положительных ионов [М]+, а регистрация молекулярного иона для трикарбоцианинов c P(O)(OH)2-группой возможна только в виде отрицательных ионов для соответствующих динатриевых солей. Нами экспeриментально определены спектральные и кинетические параметры фотовозбужденных комплексов альбумина с новыми синтетическими флуорофорами с фосфонатными заместителями в индольном фрагменте. Показано, что при добавлении HSA к раствору флуорофора наблюдается поглощение в области терапевтического окна, то есть в области 800 нм. Определены константы связывания, определены времена жизни комплексов в этаноле (595 пс) и в воде – (246 пс), получены кривые затухания комплексов и проч. взаимодействие с участием этокси-групп. Были исследованы процессы комплексообразования синтезированных красителей с другими белками крови – липопротеинами низкой плотности. В этом случае все синтезированные красители имели практически одинаковое сродство к липопротеинам низкой плотности. ри добавлении липопротеинов низкой плотности, в спектрах поглощения синтезированных красителей наблюдается падение полосы поглощения в области 780 нм с возрастанием нового максимума при 800 нм. При этом флуоресценция раствора сильно возрастает (примерно в 2–3 раза). При взаимодействии с липопротеинами низкой плотности таких определенных мест связывания не выявлено, и комплексообразование осуществляется за счет липофильных свойств цианиновых красителей. III. Впервые осуществлен и оптимизирован метод синтеза неописанных ранее конформационно закрепленных фосфонатных индотрикарбоцианинов реакцией конденсации соответствующих индолениниевых солей с заместителями – (СН2)4P(O)(OС2Н5)2 и – (СН2)4P(OН)(OС2Н5) при атоме азота с дианилом 3-хлорциклогексендикарбальдегида (см. Схема 10). Наличие атома хлора в мезо-положении гептаметиновой цепи открывает возможности дальнейшей модификации этой структуры по этому положению. Направление модификации может включать в себя введение гидрофильных групп для увеличения водорастворимости, так и введение функциональных групп для дальнейших модификаций с целью создания «drug delivery agent». Таким образом, был синтезирован ряд гептаметиновых красителей с конформационно закрепленным полиметиновым линкером для проведения систематического изучения спектрально-кинетических характеристик комплексообразования индотрикарбоцианинов такого типа с белками различной природы и дальнейшей модификации Результаты молекулярного моделирования взаимодействия фосфонатзамещенных флуорофоров с HSA. IV. Самостоятельная часть нашего исследования состоит в изучении полученных флуорофоров и их взаимодействия с белками методами математического моделирования; эта часть работы была начата в 2015 году, но окончательно развита и завершена в 2016 году. Нами впервые проведен молекулярный докинг данных флуорофоров в BSA и HSA (программа AutoDock Vina 1.1.2 software.23). Атомные заряды были рассчитаны по методу Гастайгера-Хюкеля, оптимизация геометрических параметров с использованием Tripos force field, the Sybyl-X 2.1 software.24. Анализ и визуализация комплексов с альбумином проводилась согласно UCSF Chimera 1.10.225 и Sybyl-X 2.1 software.24. Использовалась программа полужесткого докинга. Были проанализированы взаимодействия реперного кардиогрина и новых фосфонатзамещенных флуорофоров карбоцианинового типа с BSA и HSA. Данные докинга фактически предсказали выводы, сделанные при исследовании свойств комплексов спектрально-люминисцентными методами. Рассчитано, что рассматриваемые флуорофоры должны быть локализованы в достаточно обьемном полярном кармане между IIA и IIIA субдоменами альбумина (Рис.2). Один из замещенных бензоиндольных фрагментов ориентирован внутрь кармана, а другой напротив выходит из него. Эти результаты хорошо согласуются и подтверждают присутствие двух типов комплексов – комплекс с большим временем флуоресценции локализуется в гидрофобном сайте, а с более коротким временем – в более гидрофильном. V. Апробация взаимодействия бискарбоцианиновых красителей с раковыми клетками НСТ116. Нами начато изучение (в порядке инициативы) взаимодействия бискарбоцианинового красителя, синтезированного нами, с раковыми клетками НСТ116. Показано, что локализация красителя происходит в ядрах этих клеток. Были проведены эксперименты по конфокальной микроскопия (LeicaTCSSPE) внутриклеточного накопления новых флуорофоров. (Рис. 4). Последние на основании тестирования в качестве биомаркеров являются одним из перспективных лидерных красителей для медицинских целей. VI. Монография «Флуорофоры с индолениновым скаффолдом и их применение в биомедицинских целях» Группой участников гранта (Проскурнина М.В., Подругина Т.А., Кузьмин В.А., Некипелова Т.Д. Зефиров Н.С.) в 2016 году была написана монография «Флуорофоры с индолениновым скаффолдом и их применение в биомедицинскихих целях», в которой была изложена проблематика области, современное состояние и очерчены перспективы возможного развития.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".