| Результаты этапа: РЕАКЦИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ДЕЙСТВИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА (исп. М.С. Вильданова). В клетках А431 белок инволюкрин - маркер дифференцировки кератиноцитов человека - присутствует в везикулярном компартменте, расположение и морфология которого указывает на то, что это аппарат Гольджи или один из его участков. Однако в единичных или располагающихся небольшими группами клетках выявляется диффузное окрашивание всей цитоплазмы (часто у этих клеток имеются длинные отростки). В клетках HaCaT выявляется слабое диффузное окрашивание всей цитоплазмы, но в отдельных островках клеток окрашивание более яркое. Возможно, перераспределение антигена из цитозольного компартмента в мембранный связано с опухолевой трансформацией клеток. В клетках А431 в контроле в выявляется 0,93% клеток, у которых инволюкрин диффузно распределен в цитоплазме.
После инкубации с растительным гормоном - жасмоновой кислотой число таких клеток возрастает в 3,33 раза. После инкубации с растительным гормоном - абсцизовой кислотой число таких клеток достоверно не отличалось от контроля и составило в среднем 1%. Таким образом, предварительные данные показывают, что жасмоновая кислота может оказывать влияние на локализацию инволюкрина в опухолевых клетках и, возможно, это связано с нормализацией их фенотипа.
Для того, чтобы проверить, реагируют ли на растительные гормоны клетки соединительнотканного происхождения, опробовали изучаемые растительные гормоны на первичных фибробластах человека. Обнаружено, что жизнеспособность нормальных фибробластов не изменяется при действии растительных гормонов в используемом диапазоне концентраций, в то время как для нормальных кератиноцитов HaCaТ выявлено снижение жизнеспособности в ответ на действие жасмоновой кислоты и абсцизовой кислоты при концентрации 2мМ. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать в пользу того, что эффект действия растительных гормонов зависит в том числе и от тканевой принадлежности клеток.
Исследовано действие производного жасмоновой кислоты – метилжасмоната (250 мкМ – 8 мМ) на клетки А431. Полученные результаты подтверждают данные литературы о том, что метилжасмонаты являются более эффективными индукторами клеточной гибели, чем жасмоновая кислота.
ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК КОРНЯ ЛЮЦЕРНЫ MEDICAGO SATIVA L. В ХОДЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ АККЛИМАЦИИ К СОЛЕВОМУ СТРЕССУ (исп. Е.М. Лазарева). Показано, что в клетках проростков люцерны в ходе акклимации к солевому стрессу сеть кортикальных микротрубочек перестраивается, как и в клетках арабидопсиса но не только в ответ на действие ионов в составе солей (Wang C. et al., 2007), но и в ответ на действие осмотического стресса, вызванного маннитом.
|
| Результаты этапа: В ходе изучения реакции клеток животного происхождения на действие растительных факторов роста, с помощью вестерн-блоттинга, было исследовано содержание одного из белков-маркеров дифференцировки кератиноцитов - инволюкрина в культивируемых клетках эпидермоидной карциномы человека А431 и в нормальных кератиноцитах человека (НаСаТ) после воздействия растительными гормонами жасмоновой (ЖК), абсцизовой (АБК) и гиббереллиновой (ГК) кислотами. Показано, что в клетках А431 уровень экспрессии инволюкрина повышается после инкубации с растительными гормонами. В нормальных кератиноцитах НаСаТ изменения содержания инволюкрина выявлено не было. Полученные данные подтверждают наши результаты по иммуноцитохимическому выявлению инволюкрина в клетках А431, свидетельствующие о том, что после инкубации с ЖК число клеток линии А431 с характерным окрашиванием цитоплазмы возрастает в 2 раза; с данными по исследованию интенсивности белкового синтеза в клетках А431, согласно которым интенсивность белкового синтеза возрастает в опухолевых клетках после инкубации с ЖК и АБК. Следовательно, показанное нами усиление синтетической активности в клетках А431 при действии ЖК и АБК может быть связано с повышением уровня экспрессии инволюкрина, что, в свою очередь, может свидетельствовать в пользу индукции дифференцировки, вызванной действием растительных гормонов. Кроме этого, мы исследовали влияние метилжасмоната на жизнеспособность клеток НаСаТ с помощью проточной цитофотометрии, и установлено, что в этих условиях наблюдается уменьшение числа жизнеспособных клеток, и увеличение числа некротических клеток и клеток на стадиях поздней клеточной гибели. Увеличение доли клеток, меченных аннексином (апоптозы), по сравнению с контролем выявлено не было. По данным литературы известно, что во многих клеточных линиях различного тканевого происхождения МЖ вызывает апоптотическую гибель клеток. Полученные нами результаты демонстрируют, что данный растительный гормон оказывает токсическое воздействие на нормальные кератиноциты, снижая их жизнеспособность и увеличивая долю некротических клеток. Также проведено исследование влияния растительных гормонов (ЖК, МЖ, АБК, ГК) на жизнеспособность культивируемых опухолевых клеток соединительно-тканного происхождения - фибросаркомы человека линии НТ1080. Показано, что ЖК влияет на выживаемость клеток только при концентрации 2 мМ (48 часов); МЖ оказывает токсическое воздействие на клетки через 24 часа при концентрациях 1 мМ и 2 мМ, и через 48 часов при концентрациях 500 мкМ, 1 мМ и 2 мМ; при действии АБК наблюдается снижение жизнеспособности при концентрации 100 мкМ и 1 мМ (48 часов); при действии ГК (48 часов) наблюдается снижение жизнеспособности при концентрациях 500 мкМ, 1 мМ и 2 мМ. Полученные данные показывают, что МЖ оказывает наиболее выраженное влияние на жизнеспособность данного типа опухолевых клеток, и цитотоксическое действие каждого из гормонов максимально проявляется через 48 часов инкубации. Сравнивая эти данные с раннее полученными результатами на опухолевых клетках эпидермоидного происхождения А431, можно заключить, что клетки эпидермоидного происхождения являются более чувствительными к действию каждого из гормонов, так как ЖК, АБК и ГК оказывают цитотоксическое воздействие на клетки А431 в концентрации 2 мМ уже через 24 часа. Однако, МЖ (24 часа) снижает жизнеспособность клеток обеих линий с одинаковой эффективностью.
В ходе изучения влияния абиотических стрессов на цитоскелет растений, была изучена реакция системы микротрубочек клеток корня устойчивого и не устойчивого сортов ячменя в ходе акклимации к солевому и осмотическому стрессам. Объектом изучения были выбраны ячмени Hordeum vulgare L. не устойчивого сорта Белогорский и солеустойчивого сорта Эло, семена которых проращивали и культивировали в в течение 8 дней в присутствии осмотика маннита D (166,2мМ и 249,7мМ) и NaCl (99,1мМ и 145,2мМ), создающих осмотическое давление равное 405,3 кПа (4атм) и 607, 95 (6атм).
Сорт Белогорский показал сходную реакцию при обеих концентрациях агентов. При действии маннита, сеть кортикальных микротрубочек характеризовалась меньшим, по сравнению с контролем, числом пучков, хаотически ориентированными пучками, фрагментированными пучками; для митотических клеток были характерны асимметрия и уменьшение плотности веретена, фрагментирование микротрубочек препрофазного кольца, укороченные пучки митотического веретена, фрагментированные и неупорядоченные микротрубочки в составе фрагмопласта, присутствие центров конвергенции микротрубочке вблизи фрагмопласта или в кортексе. При действии NaCl в интерфазных клетках наблюдались такие же изменения микротрубочек кортикальной сети, как и при действии осмотика. В митотически делящихся клеток были выявлены асимметрия профазного и прометафазного веретена, присутствие центров конвергенции микротрубочек в профазных клетках, уменьшение числа и плотности пучков митотического веретена, нарушение упорядоченности микротрубочек в составе фрагмопласта. Сорт Эло неодинаково реагировал на разные концентрации осмотика и соли. При действии маннита 4 атм, в интерфазных клетках наблюдалось нарушение упорядоченной организации сети микротрубочек, а в делящихся клетках существенных изменений структуры систем микротрубочек отмечено не было; при 8 атм наблюдалось уменьшение числа и увеличение плотности пучков кортикальных микротрубочек, а среди митотических клеток присутствовали клетки с фрагментированными пучками веретена и пучками микротрубочек в составе фрагмопласта, нарушением упорядоченной организации микротрубочек фрагмопласта и выраженными центрами конвергенции микротрубочек. При действии NaCl 4 атм, в интерфазных и митотических клетках не было выявлено изменений в организации систем микротрубочек; при 8 атм в интерфазных клетках существенных изменений кортикальной сети микротрубочек также не наблюдалось, однако, в делящихся клетках были выявлены фрагментированные микротрубочки в составе препрофазного кольца, митотического веретена и фрагмопласта, нарушение упорядоченной организации микротрубочек в составе фрагмопласта, присутствие в цитоплазме центров конвергенции микротрубочек. Таким образом, длительная акклимация в присутствии маннита и соли у ячменя не устойчивого сорта Белогорский вызывает серьезные нарушения структуры систем интерфазных и митотических микротрубочек, причем сходные проявления этих изменений отмечается при разных концентрациях используемых агентов. Реакция растений солеустойчивого сорта ячменя Эло отличается при разных концентрациях используемых агентов. У данного сорта длительная акклимация в присутствии повышающейся концентрации маннита вызывает изменения в системах микротрубочек интерфазных и митотически делящихся клеток, при действии соли изменения наблюдаются только у митотически делящихся клеток, в то время как кортикальная сеть микротрубочек остается без изменений. |
