Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системыНИР

Search of regulators of biological processes that affect proteins, enzymes, multienzyme complexes and receptor systems

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: В отчетном году были получены важные результаты по изучению путей регуляции биологических систем разного уровня организации: белков, ферментов, полиферментных комплексов и рецепторных систем, план работы по теме за 2019 год выполнен. Изучено влияние глицеральдегид-3-фосфата на гликирующую активность фермента, показано, что длительная инкубация приводит к инактивации, что связано не с прямым гликированием фермента, а с воздействием активных форм кислорода, окисляющих сульфгидрильные группы ГАФД. Предложены возможные механизмы действия гликирующих альдегидов на энергетическое обеспечение клеток. Исследовано влияние дендримеров на амилоидную трансформацию овечьего прионного белка, продемонстрировано эффективное антиагрегационное действие катионых пиридилфениленовых дендримеров, отобраны соединения, которые могут быть использованы для предотвращения нежелательной патологической агрегации амилоидогенных белков – прионного белка и альфа-синуклеина. Выяснены особенности возникновения неэквивалентности активных центров транскетолазы, определены факторы, определяющие субстратную специфичность пенициллинацилазы и карбоксипептидазы Т, установлено, что субстратная специфичность пенициллинацилазы к ацильной части субстрата шире, чем представлялось ранее, и фермент способен превращать производные галоген-замещенных уксусных кислот, хотя эта реакция и сопровождается инактивацией фермента. Установлено, что на каталитическую активность карбоксипептидазы Т определяющее влияние оказывают небольшие изменения в ориентации боковой цепи отщепляемого аминокислотного остатка по отношению к иону цинка и остатку Glu270 в активном центре фермента. В сотрудничестве с зарубежными партнерами усовершенствована методология молекулярного моделирования ферментативных реакций с использованием метадинамики, разработана методология изучения функциональной роли дисульфидных связей в семействах белков с использованием подходов биоинформатики и молекулярного моделирования: создана программа и общедоступный веб-сервер https://biokinet.belozersky.msu.ru/yosshi. Обнаружены новые низкомолекулярные регуляторы лактатдегидрогеназы А (ЛДГ-А) и транскетолазы микобактерий, охарактеризованы природные ингибиторы тирозил-ДНК фосфодиэстеразы 1 человека. Получены высокоочищенные препараты транскетолазы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий для экспериментального изучения ингибиторов этих ферментов, отобранных в результате молекулярного моделирования и компьютерного скрининга. Создана экспериментальная модель для исследования влияния бактерий Salmonella typhimurium на апоптоз нейтрофилов, исследована возможность использования синтетического CpG-олигонуклеотида как модулятора апоптоза нейтрофилов при их взаимодействии с бактериями Salmonella typhimurium. Проведено сравнение регуляции пролиферации нормального эпителия и эпителия рака легких при действии кофермента 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (ОГДК) тиаминдифосфата (ТДФ). Показано, что высокие концентрации ТДФ в среде значительно снижают восстановительный потенциал раковых (А549), но не нормальных (Веро) клеток, что указывает на пониженную пролиферацию раковых клеток в среде с высоким содержанием ТДФ. Проведен анализ кинетики синтеза цитокинов TNF и ИЛ10 при действии агонистов толл-подобных рецепторов TLR4 и TLR3, сравнение параметров действия агонистов на различные типы клеток мозга - астроциты и нейроны. Составлен и верифицирован список генов, участвующих в синтезе оксилипинов астроцитами. Предложена схема возможного перекреста путей метаболизма оксилипинов по циклооксигеназному пути и сигнального пути активации врожденного иммунитета через TLR4 рецепторы плазматической мембраны. Проведена оценка роли оксилипинов в регуляции положительных и отрицательных обратных связей при модуляции клеточных сигнальных путей, сравнение сигналов оксилипинов через G-белок связывающие рецепторы, через фактор транскрипции PPAR, через обратный захват в фосфолипиды мембран оксилипинов, участников окислительного стресса. Оценена роль низкомолекулярных ингибиторов различных фосфолипаз на профили оксилипинов. Собрана коллекция транскриптомов, характеризующих изменения различных клеток (преимущественно макрофаги крови и других органов) при их поляризации под действием интерлейкина 4 (ИЛ4) и LPS, агониста TLR4 рецепторов. По результатам исследований в 2019 году опубликовано 19 статей, 2 статьи приняты в печать, получен патент (см. ссылку 11 в списке литературы), защищена кандидатская диссертация (Вирясова Г.М., Роль ремоделирующего хроматин комплекса PBAF в процессе миелоидной дифференцировки клеток крови человека, кандидатская диссертация по специальностям 02.00.10 - Биоорганическая химия, 03.01.03 - Молекулярная биология (хим. науки), МГУ.), сделано 8 докладов на международных конференциях. Список публикаций 1. Poursoleiman A., Karimi-Jafari MH, Zolmajd-Haghighi Z., Bagheri M., Haertlé T., Behbehani GR, Ghasemi A., Stroylova YY, Muronetz VI, Saboury AA. Polymyxinsinteraction to the human serum albumin: A thermodynamic and computational study. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Pergamon Press Ltd. (United Kingdom), 2019, 217, 155-163. 2. Sorokina Svetlana A., Stroylova Yulia Yu, Tishina Sofia A., Shifrina Zinaida B., Muronetz Vladimir I. Promising anti-amyloid behavior of cationic pyridylphenylene dendrimers: role of structural features and mechanism of action. European Polymer Journal, Pergamon Press Ltd. (United Kingdom), 2019, 116, 20-29. 3. Stanishneva-Konovalova T.B., Pichkur E.B., Semenyuk P.I., Kurochkina L.P., Sokolova O.S. ATP-bound Conformation of OBP Chaperonin. Microscopy and Microanalysis, Cambridge University Press (United Kingdom), 2019, 25 (S2), 1334-1335. 4. Anashkin V.A., Orlov V.N., Lahti R., Baykov A.A. An arginine residue involved in allosteric regulation of cystathionine β-synthase (CBS) domain-containing pyrophosphatase.Archives of Biochemistry and Biophysics, Academic Press (United States), 2019, 662 (1), 40-48. 5. Anisimov A.A., Visochinskaya Yu S., Buzin M.I., Vasil’ev V.G., Nikiforova G.G., Peregudov A.S., Dubovik A.S., Orlov V.N., Shchegolikhina O.I., Muzafarov A.M. New polydimethylsiloxanes with bulky end groups: synthesis and properties. Russian Chemical Bulletin, Springer-Verlag GmbH (Heidelberg, Germany), 2019, 68 (6), 1275-1281. 6. Vysochinskaya Yulia S., Anisimov Anton A., Peregudov Alexander S., Dubovik Alexander S., Orlov Victor N., Malakhova Yulia N., Stupnikov Alexey A., Buzin Mikhail I., Nikiforova Galina G., Vasil’ev Victor G., Shchegolikhina Olga I., Muzafarov Aziz M. Star-shapped siloxane polymers with various cyclic cores: synthesis and properties. Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry, издательство John Wiley & Sons Inc. (United States), 2019, 57 (11), 1233-1246. 7. Solovjeva Olga N., Selivanov Vitaly A., Orlov Victor N., Kochetov German A. Stages of the formation of nonequivalence of active centers of transketolase from baker’s yeast. MOLECULAR CATALYSIS, 2019, 466, 122-129. 8. Панин Н.В., Никулин М.В., Тюрин Е.С., Дробот В.В., Морозова И.А., Швядас В.К., Изучение возможностей использования 2-галоген-замещенных ацетамидов в качестве ацильных доноров в реакциях, катализируемых пенициллинацилазами, Acta Naturae (русскоязычная версия), 2019, 11, № 2, 77-81. 9. V.Kh. Akparov, V.I. Timofeev, G.E. Konstantinova, I.G. Khaliullin, I.P. Kuranova, T.V. Rakitina, V. Švedas, The nature of the ligand’s side chain interacting with the S1'-subsite of metallocarboxypeptidase T from Thermoactinomyces vulgaris determines the geometry of the tetrahedral transition complex? PloS One, 2020 (PONE-D-19-27311). 10. M. Bonomi, G. Bussi, C. Camilloni, Tribello G.A., P. Banáš, A. Barducci, M. Bernetti, Bolhuis P.G., S. Bottaro, D. Branduardi, R. Capelli, P. Carloni, M. Ceriotti, A. Cesari, H. Chen, W. Chen, F. Colizzi, S. De, M. De La Pierre, D. Donadio, V. Drobot, B. Ensing, Ferguson A.L., M. Filizola, Fraser J.S., H. Fu, P. Gasparotto, F.L. Gervasio, F. Giberti, A. Gil-Ley, T. Giorgino, Heller G.T., Hocky G.M., M. Iannuzzi, M. Invernizzi, Jelfs K.E., A. Jussupow, E. Kirilin, A. Laio, V. Limongelli, K. Lindorff-Larsen, T. Löhr, F. Marinelli, L. Martin-Samos, M. Masetti, R.Meyer, A. Michaelides, C. Molteni, T. Morishita, M. Nava, C. Paissoni, E. Papaleo, M. Parrinello, J. Pfaendtner, P. Piaggi, G.M. Piccini, A. Pietropaolo, F. Pietrucci, S. Pipolo, D. Provasi, D. Quigley, P. Raiteri, S. Raniolo, J. Rydzewski, M. Salvalaglio, G.C. Sosso, V. Spiwok, J. Šponer, Swenson D.W.H, P. Tiwary, O. Valsson, M. Vendruscolo, Voth G.A., A. White, Promoting transparency and reproducibility in enhanced molecular simulations, Nature Methods, 2019, 16, № 8, 670-673. 11. Нилов Д.К., Гущина И.В., Щербакова Т.А., Балдин С.М., Швядас В.К., Применение фурансульфонатов для ингибирования транскетолазы патогена Mycobacterium tuberculosis, «Изобретения. Полезные модели» Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности (Роспатент), 2019 г., № 29, патент RU 2703465. Текст: https://www1.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&DocNumber=2703465&TypeFile=html 12. Dyrkheeva N., Luzina O., Filimonov A., Zakharova O., Ilina E., Zakharenko A., Kuprushkin M., Nilov D., Gushchina I., Švedas V., Salakhutdinov N., Lavrik O., Inhibitory Effect of New Semisynthetic Usnic Acid Derivatives on Human Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1, Planta Medica, 2019, 85, № 2, 103-111. 13. Schmalhausen EV, Shumkov MS, Muronetz VI, Svedas VK, Expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from M. tuberculosis in E. coli. Purification and characteristics of the untagged recombinant enzyme, Protein Expression and Purification, 2019, 157, 28-35. 14. Golenkina EA, Viryasova GM, Galkina SI, Arifulin EA, Gaponova TV, Romanova YM, Sud'ina GF. (2019) Synthetic CpG oligonucleotides as potential modulators of neutrophil survival in PAMP-associated inhibition of apoptosis. J Leukoc Biol. 106(1):45-55. doi: 10.1002/JLB.3MIA1118-435R. 15. Viryasova GM, Golenkina EA, Tatarskii VV Jr, Galkin II, Sud'ina GF, Soshnikova NV. (2019) An optimized permeabilization step for flow cytometry analysis of nuclear proteins in myeloid differentiation of blood cells into neutrophils. MethodsX. 6:360-367. doi: 10.1016/j.mex.2019.02.011. eCollection 2019. 16. Viryasova GM, Tatarskiy VV Jr, Sheynov AA, Tatarskiy EV, Sud'ina GF, Georgieva SG, Soshnikova NV. (2019) PBAF lacking PHD domains maintains transcription in human neutrophils. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866(12):118525. doi: 10.1016/j.bbamcr.2019.118525. 17. Aleshin, V. A., G. V. Mkrtchyan and V. I. Bunik (2019). "Mechanisms of Non-coenzyme Action of Thiamine: Protein Targets and Medical Significance." Biochemistry (Moscow) 84(8): 829-850. 18. Itkis, Y., T. Krylova, N. L. Pechatnikova, A. De Grassi, V. Y. Tabakov, C. L. Pierri, V. Aleshin, A. Boyko, V. I. Bunik and E. Y. Zakharova (2019). "A novel variant m.641A>T in the mitochondrial MT-TF gene is associated with epileptic encephalopathy in adolescent." Mitochondrion 47: 10-17. 19. Wagner, T., A. Boyko, P. M. Alzari, V. I. Bunik and M. Bellinzoni (2019). "Conformational transitions in the active site of mycobacterial 2-oxoglutarate dehydrogenase upon binding phosphonate analogues of 2-oxoglutarate: From a Michaelis-like complex to ThDP adducts." J Struct Biol 208(2): 182-190. 20. Бойко А.И. (2019) "Травмы мозга и механизмы нейропротекторного действия тиамина." Россия и Германия. Научный гумбольдтовский журнал, ISSN 2227-6807, №1-2 (13-14):109-118 21. Крюков Д.В. (2019) "Терапия эпилепсий: роль диагностики дисфункций витамин-зависимых ферментов." Россия и Германия. Научный гумбольдтовский журнал, ISSN 2227-6807, №1-2 (13-14):100-108 22 Aleshin V., Kaehne T., Mkrtchyan G., Artiukhov A., Graf A., Maslova M., Bunik V. (2019) «P.252 Regulation of glutamate dehydrogenase in the brain by acetylation and thiamine». European Neuropsychopharmacology. ISSN 0924977X, 29, S191-S192, doi: 10.1016/j.euroneuro.2019.09.291.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: ОТЧЕТ ПО БЮДЖЕТНОЙ ТЕМЕ: В последние годы бурное развитие методов геномики, протеомики, метаболомики и транскриптомики привело к увеличению объемов доступных данных о структуре и функции ферментов. Первичные базы данных, собирающие информацию об аминокислотных последовательностях и структурах белков, растут в геометрической прогрессии. Активно развиваются вторичные базы данных, обобщающие структурную и функциональную информацию, классифицирующие белки/ферменты с разным строением, свойствами и происхождением. Анализ этой информации открывает новые возможности для понимания структурно-функциональных взаимосвязей в белках, однако требует новых методов анализа. Для больших суперсемейств белков (таких как α/β-гидролазы, PLP-зависимые ферменты различных типов) характерна сложная иерархия функциональных свойств и различий. Т.е. представители (конкретные ферменты), принадлежащие к одному суперсемейству, различаются по типу катализируемой реакции/реакционной специфичности, субстратной специфичности, зависимости активности и стабильности от pH, температуры, среды протекания реакции, и т.д. Эти свойства могут регулироваться разными механизмами и структурными факторами. Можно ожидать, что функциональная кластеризация родственных белков, т.е. распределение представителей суперсемейства по функциональным группам, будет зависеть от конкретного свойства/функции, при этом число таких функциональных кластеризаций белков одного суперсемейства будет не единственным и отражать сложную иерархию структурно-функциональных особенностей эволюционно удаленных, но родственных белков. Сложившиеся методы функциональной классификации ферментов обладают следующими фундаментальными недостатками: (1) они рассматривают функцию фермента как единое понятие, отражающее способность катализировать определенное химическое превращение (при этом не учитываются появляющиеся в последнее время сведения о способности многих ферментов катализировать разные химические превращения); (2) для каждого набора родственных ферментов предполагается возможной единственная кластеризация по функции; (3) большинство методов основывают кластеризации на поиске глобальных сходств и отличий последовательностей и структур разных белков, не принимая во внимание тот факт, что даже точечные замены в структуре белка могут привести к принципиальному изменению его свойств, например, типу катализируемой реакции (см, например, случай оксинитрилазы из Sorghum bicolor и ее сходства с гомологичным ферментом карбоксипептидазой: Gruber K., Kratky C. (2004) Biopolymers for biocatalysis: Structure and catalytic mechanism of hydroxynitrile lyases. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 42(3), 479-486). Таким образом, существующие методы функциональной классификации не только ферментов, но и белков в целом, не учитывают тот факт, что в рамках структуры одного белка возможна реализация нескольких функциональных свойств, и для изучения структурно-функциональных взаимосвязей в больших суперсемействах белков необходимы новые подходы. В отчетном году работа была направлена в сторону сравнительного анализа и функциональной классификации белков на уровне 3D-структур. С биологической точки зрения, анализ трехмерных структур представляется более точным и информативным в сравнении с анализом только аминокислотных последовательностей. Особо критичными эти преимущества становятся при сравнении и тонкой классификации эволюционно удаленных гомологов, которые приобрели функциональное разнообразие в результате накопления изменений и мутаций, когда аминокислотные последовательности сильно различаются и их анализ не может быть проведен без учета 3D-информации. Исследования были сосредоточены на функциональной классификации суперсемейств белков с использованием «3D-мотивов» – координатных реплик ключевых остатков в структуре сайтов связывания белков, обуславливающих выполнение ими конкретных функций. Биоинформатический анализ белков на уровне локальной организации фрагментов 3D-структуры («3D-мотивов») был впервые предложен 20-30 лет назад, но не получил широкого применения из-за ограниченной доступности 3D-данных. В последнее время использование «3D-мотивов» в биоинформатике становится возможным по мере накопления все большего количество доступных PDB структур. Появились различные программные решения для изучения белков на уровне «3D-мотивов», однако в большинстве случаев они представлены в виде узкоспециализированных веб-серверов, что позволяет использовать их только для решения ограниченного типа задач, при этом масштаб работы ограничен вычислительными возможностями сторонних веб-серверов по объему входных данных. В этой связи была начата разработка универсального подхода для сравнительного анализа и функциональной классификации белков на уровне 3D-мотивов и создана первая версия программного обеспечения для функциональной классификации и сравнительного анализа белков на основе изучения особенностей организации локальной 3D-структуры («3D-мотивов»). Для этого, в том числе, было использовано как ранее разработанное стороннее программное обеспечение, так и оригинальные программы лаборатории - Mustguseal (для поиска структур родственных белков в банке данных PDB) и parMATT (для выравнивания структур). Для построения и сравнения «3D-мотивов» используются две метрики: универсальная метрика на основе RMSD и специализированная на основе простых и дигедральных углов. Для кластеризации/классификации мотивов (и соответствующих белков) использовались методы машинного обучения. В первой версии разрабатываемого программного обеспечения реализованы три широко используемых метода кластерного анализа: HDBSCAN, OPTICS и DBSCAN для решения разных задач. HDBSCAN и OPTICS - полностью автоматические методы: HDBSCAN позволяет сохранить максимум данных для дальнейшего экспертного анализа, создавая «более толстые» кластеры и минимизируя количество выбросов (то есть уникальных/редких ориентаций), OPTICS, напротив, обычно производит пространственно более компактные и «более тонкие» кластеры, отклоняя большее количество конформаций как выбросы. DBSCAN - курируемый метод, результаты которого определяются входным параметром «eps», калибруемым вручную в соответствии с выбранной целью исследования. Полученный опыт и программное обеспечение для построения и анализа 3D-мотивов использованы для построения трехмерных слепков функционально важных аминокислот в центрах связывания и аннотации новых центров в ферментах. Для этого с использованием методов parMATT и Mustguseal были собраны неизбыточные выборки и построены множественные структурные выравнивания следующих суперсемейств – α/β-гидролаз, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ, Ntn-гидролаз, сериновых β-лактамаз. Проведен первичный анализ полученных структурных выравниваний, установлены первичные наборы характеристических признаков (3D-мотивов), проведено их сравнение. Разработан план дальнейшего развития подхода к построению и анализу 3D-мотивов в структурах белков для их сравнительного анализа и функциональной классификации. Разрабатываемый подход и соответствующее программное обеспечение будут в дальнейшем использованы для изучения взаимосвязи между структурой и функцией белков/ферментов, а также при решении практически важных задач получения препаратов белков с измененными функциональными свойствами и дизайна их модуляторов. С целью изучения механизма действия ферментов, путей регуляции их функциональных свойств и поиска ингибиторов активно использовались и разрабатывались методы молекулярного моделирования. Для эффективного компьютерного скрининга библиотек химических соединений и новых ингибиторов ферментов был разработан веб-сервер структурной фильтрации vsFilt, доступный по адресу https://biokinet.belozersky.msu.ru/vsfilt. vsFilt позволяет учитывать роль наиболее важных взаимодействий между тестируемой молекулой ингибитора/лиганда и белком-мишенью в образующемся комплексе (водородные связи, галогенные связи, ионные взаимодействия, гидрофобные контакты, пи-стэкинг, катион-пи взаимодействия) и отбирать лекарствоподобные соединения. Разработанный подход реализован при поиске ингибиторов и ранее неизвестных субстратов ряда ферментов (поли(ADP-рибозо)полимеразы, пенициллинацилазы, бета-лактамазы). Поли(ADP-рибозо)полимераза 1 (ПАРП-1) является ключевым ферментом репарации ДНК и важной мишенью для терапии онкологических заболеваний. Сложное строение субстратов ПАРП-1 ограничивает возможности экспериментального изучения механизма реакции, однако необходимые данные могут быть получены путем молекулярного моделирования. В отчетном году впервые была получена молекулярно-динамическая модель фермент-субстратного комплекса ПАРП-1, содержащего молекулу NAD+ и конец цепи поли(ADP-рибозы). Охарактеризованы взаимодействия с остатками активного центра, а также предложен SN1-подобный механизм для катализируемой реакции ADP-рибозилирования, что имеет важное значение для рационального дизайна конкурентных ингибиторов ПАРП-1. Был детально исследован молекулярный механизм действия природного ингибитора ПАРП-1, 7-метилгуанина, охарактеризованы взаимодействия между ингибитором, ферментом и нуклеосомной ДНК. Показано, что 7-метилгуанин конкурирует с субстратом NAD+ за связывание в активном центре, образуя взаимодействия с остатками Gly863, Ala898, Ser904, and Tyr907, подавляет ДНК-зависимую ферментативную активность и приводит к образованию непродуктивных комплексов ПАРП-1 с нуклеосомой. Молекулярно-динамическое моделирование позволило изучить взаимодействие протеазы ZMPSTE24 с пептидным субстратом (SPRTQSPQNCSIM), установить участие остатков Leu283, Val332, Leu438 активного центра фермента в полости Р3 в образовании контактной поверхности с гидрофобной боковой группой изолейцина преламина А. Наряду с этим, неполярные остатки полости P1 Ile351, Leu407, Leu410, Phe414 способны формировать интерфейс с фарнезильной группой модифицированного остатка цистеина С-конца преламина А. Предположено, что связывание С-конца преламина в полостях P1 и P3 определяет путь протеолиза и приводит к образованию продуктивного фермент-субстратного комплекса с необходимой ориентацией карбонильной группы расщепляемой пептидной связи по отношению к каталитическому иону цинка в активном центре. При помощи метадинамики изучен механизм взаимодействия ZMPSTE24 с экспериментально обнаруженным ингибитором лапиновиром. Обнаружено, что доставка ингибитора во внутреннюю полость происходит через сквозной канал в структуре белка, который, предположительно, обеспечивает удаление продукта ферментативной реакции (олигопептида с модифицированной фарнезильной группой аминокислотного остатка цистеина). Структурная организация сквозного канала и химическая природа образующих его аминокислотных остатков являются важнейшими факторами, определяющими взаимодействие фермента с уходящей группой субстрата. Изучение функционирования внутренней полости фермента показало, что внутренняя полость через этот канал способна также активно обмениваться молекулами воды с окружающим раствором. Блокирование канала приводит к подавлению активности фермента. В результате компьютерного скрининга библиотеки из 3-х тысяч низкомолекулярных соединений, отобранных для подавления активности широкого класса матриксных металлопротеиназ MMpI, были выявлены соединения, способные наиболее эффективно связываться в активном центре ZMPSTE24 и взаимодействовать с ионом цинка. При дальнейшем изучении с использованием метадинамики были отобраны четыре потенциальных ингибитора для дальнейшего экспериментального изучения. Изучена специфичность гомологичного ряда фосфоновых аналовов 2-оксоглутарата в отношении ингибирования пусковых изоферментов полиферментных комплексов животных тканей: 2-оксоглутаратдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы, кодируемых генами ogdhl и dhtkd1, соответственно. Полученные результаты показали достаточно высокую специфичность действия сукцинилфосфоната на 2-оксоглутаратдегидрогеназу и адипоилфосфоната на 2-оксоадипатдегидрогеназу, в то время как аналог с промежуточной длиной углеродной цепи, глутарилфосфонат, был сравнимым по силе ингибитором обоих изоферментов. С использованием специфического действия аналогов 2-оксокислот на их ферменты-мишени in vivo показаны специфические физиологические эффекты направленной регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот мозга в животных моделях интраназального введения аналогов. Продолжено исследование витамина В1 (тиамина) и его производных в качестве метаболических регуляторов животных клеток с нормальным метаболизмом и после злокачественного перерождения. Показана роль тиамина в ацетилировании, регулирующем связывание аллостерических эффекторов ключевого фермента метаболизма глутамата в мозге – глутаматдегидрогеназы – и зависимость такой регуляции от времени суток. С помощью аффинной хроматографии на тиамин-содержащем носителе выделены изоформы глутамат- и малатдегидрогеназ мозга животных с высокой степенью активации тиамином и/или тиаминдифосфатом. На основе ранее полученных данных об антираковом действии тиамина и тиаминдифосата в клетках аденокарциномы легочного эпителия и связи такого действия с р53-зависимой регуляцией проведен биоинформатический поиск потенциальных сайтов связывания р53 с участками старта транскрипции генов, кодирующих тиамин-зависимые ферменты. Предсказанные сайты сопоставлены с опубликованными данными о р53-зависимой регуляции данных ферментов. Экспериментально показано, что факторы, приводящие к изменению экспрессии р53 в клетках аденокарциномы легочного эпителия, меняют активности ферментов, регулируемых тиамином по коферментному и некоферментному механизмам. С целью дальнейшей характеристики взаимной регуляции метаболизма витаминов В1 (тиамина) и В6 (пиридоксаля) у животных проведено изучение мутаций ферментов метаболизма пиридоксаля, а также их энзимологических и физиологических последствий. Были продолжены исследования взаимодействий между различными биомолекулами и белками-мишенями, в том числе ферментами энергетического обмена, с целью средств лечения и профилактики заболеваний, связанных с индукцией апоптоза (преимущественно в нервных тканях). Так были подробно изучены механизмы одно-субстратной реакции, катализируемой транскетолазой, участвующей в пентнозофосфатном пути и играющей важную роль в обеспечении клеток различными сахарами и кофакторами. Были установлены неизвестные ранее особенности катализа этим ферментом одно-субстратной реакции и разработаны методы кинетического анализа этого процесса. Кроме того, были подробно изучены каталитические свойства комплекса транскетолазы с РНК, обнаруженного ранее в пекарских дрожжах. Было обнаружено, что РНК, входящая в этот комплекс, представляет собой рибозим, который катализирует взаимное превращение глицеральдегид-3-фосфата (G3P) и дигидроксиацетон-3-фосфата (DHAP), т.е. действует как триозофосфат-изомераза (TPI). Он также катализирует необычную реакцию разложения рибозо-5-фосфата (R5P) до G3P и эритрозы. TPI-рибозим был обнаружен в пекарских дрожжах не только в комплексе с транскетолазой, но и в свободной форме. Комплекс транскетолаза-РНК легко выделялся на иммуноаффинной колонке с антителами к транскетолазе. TPI-рибозим состоит из 87 нуклеотидов и имеет молекулярную массу 26,6 кДа. Оптимум pH-активности составляет 7,5 для DHAP, 6,7 для R5P и 9,0 для G3P. Km и Vmax составляют соответственно 0,29 мМ и 2,6 Ед / мг для DHAP, 22 мМ и 0,65 Ед / мг для R5P, 0,05 мМ и 4,3 Ед / мг при pH 7,6 и 0,11 мМ и 16 Ед / мг при pH 9,0 для G3P. Эти кинетические характеристики одинаковы для свободной РНК и в комплексе с транскетолазой. Ki для связывания РНК с транскетолазой составлял 1,0 мкМ. Соответственно, TPI-рибозим выполняет двойную функцию - с одной стороны он проявляет активность TPI, а с другой - блокирует работу транскетолазы, тем самым переключая метаболический процесс на гликолиз. Определяется местоположение гена рибозима TPI. Блокирование активности транскетолазы рибозимом может иметь практическое значение в медицине, в частности, в терапии рака. Было продолжено изучение взаимодействия природных и синтетических производных коричной кислоты с амилоидогенными белками. Было установлено, что некоторые вещества из этой группы эффективно предотвращают патологическую трансформацию альфа-синуклеина, являющегося одним из основных участников возникновения различных синуклеинопатий, в том числе и болезни Паркинсона. Для дальнейшего изучения влияния этих соединений на трансформацию альфа-синуклеина в условиях, близких к естественным, была получена модельная система на основе клеток нейробластомы SH-SY5Y, стабильно продуцирующих альфа-синуклеин дикого типа, а также его мутантные формы. С целью изучения роли шаперонинов в развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы были выделены и охарактеризованы различные фаговые шаперонины и сформулированы гипотезы об их роли в патологической трансформации амилоидогенных белков. Были также проведены исследования влияния дендримеров на амилоидную трансформацию некоторых белков и рассмотрены возможности использования различных соединений, в том числе биодеградируемых термочувствительных олигохитозановых наночастиц, для доставки биологически активных соединений. В экспериментальной модели взаимодействия нейтрофилов с бактериями Salmonella typhimurium проведена работа по селекции синтетических фрагментов ДНК с наибольшим потенциалом активации/ингибирования фагоцитоза и синтеза лейкотриенов в нейтрофилах. При исследовании функциональных ответов нейтрофилов человека были охарактеризованы структуры по принципу баланса между максимальным подавлением антиапоптотического действия бактерий и минимальными побочными эффектами в виде неспецифической активации продукции активных форм кислорода/азота нейтрофилами. Было проведено исследование фагоцитоза и стимулированного фагоцитозом синтеза лейкотриенов в экспериментальной модели взаимодействия нейтрофилов с бактериями Salmonella typhimurium, при добавлении олигонуклеотидов различной структуры. Используя анализ ВЭЖХ, проточную цитометрию и другие биохимические методы изучено влияние синтетических олигодезоксирибонуклеотидов (ODN), способных сворачиваться в G-квадруплексные структуры, на синтез лейкотриенов в нейтрофилах. ODN содержали теломерные TTAGGG-повторы (G4), в том числе с фосфоротиоатными олигогуанозинами, присоединенными к концу (-ам) ядра G-квадруплекса. Исследование структуры методами КД и УФ-спектроскопии показало, что присутствие олигогуанозинов, фланкирующих последовательность G4, приводит к кардинальным изменения топологии G-квадруплекса. В то время как G4 складывается в единую антипараллельную структуру, в модифицированных ODN выявлены антипараллельная и параллельная структуры. Показано, как модификации базовой теломерной структуры влияют на фагоцитарную активность нейтрофилов и синтез лейкотриенов. Добавление бактерий к нейтрофилам резко снижало апоптоз нейтрофилов. Из-за своего клинического значения S. typhimurium широко используется как модельный организм для изучения взаимодействий между клетками хозяина и патогеном. Для обращения эффекта бактерий на апоптоз важнейшую роль играет способность олигонуклеотидов (ODN) индуцировать продукцию ROS. Если в действии теломерных последовательностей на синтез лейкотриенов в фагоцитирующих нейтрофилах решающим фактором была их способность формировать устойчивые G–квадруплексы), то при активации апоптоза нейтрофилов максимальную эффективность проявили ODN смешанного состава - с фосфоротиоатными олигогуанозинами по концам ядра G-квадруплекса. Для разделения апоптотических и некротических клеток использовалось одновременное окрашивание меченным AlexaFluor 488-аннексином V, что позволяет оценить выраженность экстернализации фосфатидилсерина (зеленая флуоресценция), и йодистым пропидием (PI), маркером целостности наружных мембран (красная флуоресценция). Образование ROS/RNS под действием (TTAGGG)-ODN и их модифицированных аналогов позволило отобрать структуры по принципу баланса между максимальным подавлением антиапоптотического действия бактерий и минимальными побочными эффектами в виде неспецифической активации продукции ROS/RNS нейтрофилами. Проведен дальнейший анализ изменений транскриптомов клеток с различной поляризацией и поведения генов каскадов синтеза оксилипинов. Для выявления списков маркеров поляризации проведено сопоставление данных (транскриптомов), полученных на астроцитах, макрофагах и других типах клеток, обработанных интерлейкинами (IL-4, IL-10) или липополисахаридом (LPS). Анализировали данные РНК-секвенирования клеточных экспериментов поляризации астроцитов и макрофагов людей и животных (крыса, мышь). Результаты анализа представлены в открытом доступе в базах данных GEO (NCBI) и ENA (EMBL-EBI). Была разработана методика поиска транскриптомных датасетов в открытых базах данных. Первичную обработку данных проводили инструментом Salmon (v1.3.0), затем суммировали данные экспрессии на уровне генов с помощью пакета R tximport (v1.16.1). Также был выполнен анализ дифференциальной экспрессии генов (DESeq2). Выявленные релевантные маркеры были разделены на провоспалительные (классическая поляризация) и противовоспалительные (альтернативная поляризация). В клеточных экспериментах была проведена предварительная оценка действия лигандов ядерных рецепторов PPAR (агонистов и антагонистов) на клеточную поляризацию. Получены метаболомные данные и проведен их анализ, Для разработки к анализа метаболомных данных проведено сравнение липидомных профилей в различных жидкостях в моделях воспаления глаз на кроликах. Проведен анализ оксилипиновых профилей, полученных в различных условиях, с целью оценки возможности использования оксилипинов как диагностических маркеров воспалительных процессов и нарушений протекания ответов врожденного иммунитета. Полученные результаты позволяют предполагать возможность такого использования. Для усиления высказанного предположения проведено сравнение оксилипиновых профилей при действии ингибиторов митогенактивируемых протеинкиназ, ингибиторов митохондриального метаболизма на астроцитах и макрофагах. Начата подготовка данных анализа к теоретическому обобщению. По результатам исследований в 2020 году опубликованы 32 статьи, сделано 9 докладов на российских и международных конференциях, защищено 5 дипломных и 6 курсовых работ. Список опубликованных статей. 1. Gushchina I.V., Polenova A.M., Suplatov D.A., Švedas V.K., Nilov D.K. vsFilt: A tool to improve virtual screening by structural filtration of docking poses. (2020) J. Chem. Inf. Model., 60, 3692-3696. 2.Nilov D., Maluchenko N., Kurgina T., Pushkarev S., Lys A., Kutuzov M., Gerasimova N., Feofanov A., Švedas V., Lavrik O., Studitsky V.M. Molecular mechanisms of PARP-1 inhibitor 7-methylguanine. (2020) Int. J. Mol. Sci., 21, 2159. 3.Zamaraev A.V., Volik P.I., Nilov D.K., Turkina M.V., Egorshina A.Y., Gorbunova A.S., Iarovenko S.I., Zhivotovsky B., Kopeina G.S. Requirement for serine-384 in caspase-2 processing and activity. (2020) Cell Death Dis., 11, 825. 4.Нилов Д.К., Пушкарев С.В., Гущина И.В., Манасарян Г.А., Кирсанов К.И., Швядас В.К. Моделирование фермент-субстратных комплексов поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 человека. (2020) Биохимия, 85, 116-125. 5.Suplatov D., Sharapova Y., Švedas V. easyAmber: A comprehensive toolbox to automate the molecular dynamics simulation of proteins. Journal of Bioinformatics and Computational Biology, 2020, 18(3), 2040011. 6.Кирилин Е.М., Швядас В.К. Анализ траектории образования промежуточного гликозилфермента в механизме действия нейраминидазы вируса гриппа А методами молекулярного моделирования. Биохимия, 2020, 85(4), 567-577. 7.Подшивалов Д.Д., Кирилин Е.М., Коннов С.И., Швядас В.К. Структурная организация и динамические характеристики участка связывания ингибиторов конформационной перестройки гемагглютинина вируса гриппа H3N2 и H7N9. Биохимия, 85(4), 578-586. 8.Aleshin V.A., Mkrtchyan G.V., Kaehne T., Graf A.V., Maslova M.V., Bunik V.I. (2020) Diurnal regulation of the function of the rat brain glutamate dehydrogenase by acetylation and its dependence on thiamine administration. Journal of Neurochemistry, 153: 80-102, doi.org/10.1111/jnc.14951. 9.Boyko AI, Artiukhov AV, Kaehne T, di Salvo ML, Bonaccorsi di Patti MC, Contestabile R, Tramonti A, Bunik VI. (2020) Isoforms of the DHTKD1-Encoded 2-Oxoadipate Dehydrogenase, Identified in Animal Tissues, Are not Observed upon the Human DHTKD1 Expression in Bacterial or Yeast Systems. Biochemistry Moscow, 85::920-929, doi: 10.1134/S0006297920080076. 10.Song JY, Fan B, Che L, Pan YR, Zhang SM, Wang Y, Bunik V, Li GY. (2020) Suppressing endoplasmic reticulum stress-related autophagy attenuates retinal light injury. Aging 12:16579-16596, doi: 10.18632/aging.103846. 11.Barile A, Nogués I, di Salvo ML, Bunik V, Contestabile R, Tramonti A. (2020) Molecular characterization of pyridoxine 5'-phosphate oxidase and its pathogenic forms associated with neonatal epileptic encephalopathy. Sci Rep 10:13621, doi: 10.1038/s41598-020-70598-7. 12.Contestabile R, di Salvo ML, Bunik V, Tramonti A, Vernì F. (2020) The multifaceted role of vitamin B 6 in cancer: Drosophila as a model system to investigate DNA damage. Open Biol 10:200034, doi: 10.1098/rsob.200034. 13.Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI (2020) Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD(+) quantification in biological samples. Analytical Biochemistry, 603: 113797, Doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. 14.Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Krishnan S, Karlsson A. (2020 г.) Regulation of Thiamine (Vitamin B1)-Dependent Metabolism in Mammals by p53. Biochemistry Moscow, 8: 801-807. Doi: 10.1134/S0006297920070081. 15.Bunik V.I., Aleshin V.A., Zhou X., Tabakov V. Yu, Karlsson A. (2020) Activation of Mitochondrial 2-Oxoglutarate Dehydrogenase by Cocarboxylase in Human Lung Adenocarcinoma Cells A549 Is p53/p21-Dependent and Impairs Cellular Redox State, Mimicking the Cisplatin Action. Int. J. Molec. Sci. 21: 3759, doi: 10.3390/ijms21113759. 16.Graf A., Trofimova L., Ksenofontov A., Baratova L., Bunik V. (2020) Hypoxic Adaptation of Mitochondrial Metabolism in Rat Cerebellum Decreases in Pregnancy. Cells 9: 139. doi: 10.3390/cells9010139. 17.Artiukhov A.V., Grabarska A., Gumbarewicz E., Aleshin V.A., Kähne T,. Obata T., Kazantsev A.V., Lukashev N.V., Stepulak A., Fernie A.R., Bunik V.I. (2020) Synthetic analogues of 2-oxo acids discriminate metabolic contribution of the 2-oxoglutarate and 2-oxoadipate dehydrogenases in mammalian cells and tissues. Sci Rep. 10: 1886. doi: 10.1038/s41598-020-58701-4. 18.Mezhenska O. A., Aleshin V. A., Kaehne T., Artiukhov A. V., Bunik V. I. (2020), Regulation of Malate Dehydrogenases and Glutamate Dehydrogenase of Mammalian Brain by Thiamine in vitro and in vivo. Biochemistry Moscow 85: 27-39. doi:10.1134/S0006297920010034 (English translation). 19.Aleshin V.A., Artiukhov A. V., Mezhenska O. A., Parkhomenko J.M., Kaehne T., Bunik V. I. (2020) Phosphatases of thiamine mono- and diphosphate in bovine brain synaptosomes. Biochemistry Moscow, 85: 378-386 doi: 10.1134/S000629792003013X (English translation). 20.Solovjeva O.N. The mechanism of a one-substrate transketolase reaction. Part II. Anal Biochem. 2021, 613:114022. 21. Solovjeva O.N., Kovina M.V., Zavialova M.G., Zgoda V.G., Shcherbinin D.S., Kochetov G.A. The mechanism of a one-substrate transketolase reaction. Biosci Rep. 2020, 28;40(8):BSR20180246. 22. Solovjeva O.N. Triosephosphate isomerase from baker’s yeast – ribozyme versus protein. Open journal of analytical and bioanalytical chemistry. 2020, 4 (1): 020-028. 23. Medvedeva M., Barinova K., Melnikova A., Semenyuk P., Kolmogorov V., Gorelkin P., Erofeev A., Muronetz V. Naturally occurring cinnamic acid derivatives prevent amyloid transformation of alpha-synuclein. Biochimie, 2020, 170: 128-139. 24. Melnikova A., Pozdyshev D., Barinova K., Kudryavtseva S., Muronetz V.I. Alpha-synuclein overexpression in SH-SY5Y human neuroblastoma cells leads to the accumulation of thioflavin S-positive aggregates and impairment of glycolysis. Biochemistry (Moscow, перевод), 2020, 85 (5): 604-613. 25. Semenyuk P.I., Moiseenko A.V., Sokolova O.S., Muronetz V.I., Kurochkina L.P. Structural and functional diversity of novel and known bacteriophage-encoded chaperonins. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 157: 544-552. 26. Sorokina S., Stroylova Y., Muronetz V., Shifrina Z. Role of structural features of dendrimers in the anti-amyloidogenic properties. ИНЭОС OPEN, 2020, 3 (2): 1-9. 27. Burova T.V., Grinberg V.Y., Grinberg N.V., Dubovik A.S., Tikhonov V.E., Orlov V.N., Plashchina I.G., Alvarez-Lorenzo C., Khokhlov A. R. Biodegradable thermoresponsive oligochitosan nanoparticles: Mechanisms of phase transition and drug binding-release. International Journal of Biological Macromolecules, 2020,164:1451-1460. 28. Akatyev Nikolay V., Yl’in Mikhail M., Yl’in Mikhail M., Peregudova Svetlana M., Peregudov Alexander S., Buyanovskaya Anastasiya G., Kudryavtsev Kirill R., Dubovik Alexander S., Grinberg Valeriy Ya, Orlov Victor N., Ilya Volkov, Pavlov Alexander A., Novikov Valentin V., Belokon Yuri N. Chan-Evans-Lam C-N Coupling Promoted by a Dinuclear Cu(II) Complex. Catalytic Performance and Some Evidence for the Mechanism of CEL Reaction Obviating Cu(III)/Cu(I) Cycle. ChemCatChem, 2020:10158-0012. 29.Golenkina EA, Viryasova GM, Dolinnaya NG, Bannikova VA, Gaponova TV, Romanova YM, Sud'ina GF. The Potential of Telomeric G-quadruplexes Containing Modified Oligoguanosine Overhangs in Activation of Bacterial Phagocytosis and Leukotriene Synthesis in Human Neutrophils. Biomolecules. 2020; 10(2):249. doi: 10.3390/biom10020249. 30.Sud’ina Galina F., Viryasova Galina M., Golenkina Ekaterina A., Galkina Svetlana I., Romanova Yulia M., Dolinnaya Nina G. Synthetic Oligodeoxynucleotides in the Regulation of Leukotriene Synthesis in Human Neutrophils. FASEB Journal, Volume34, Issue S1, № S1, с.1; doi: 10.1096/fasebj.2020.34.s1.00635. 31.Chistyakov D.V., Gancharova O.S., Baksheeva V.E., Tiulina V.V., Goriainov S.V., Azbukina N.V., Tsarkova M.S., Zamyatnin A.A., Philippov P.P., Sergeeva M.G., Senin I.I., Zernii E.Yu. Inflammation in Dry Eye Syndrome: Identification and Targeting of Oxylipin-Mediated Mechanisms. BIOMEDICINES, 2020, 8(9), 344. 32.Chistyakov D.V., Azbukina N.V., Astakhova A.A., Goriainov S.V., Chistyakov V.V., Tiulina V.V., Baksheeva V.E., Kotelin V.I., Fedoseeva E.V., Zamyatnin A.A., Philippov P.P., Kiseleva O.A., Bessmertny A.M., Senin I.I., Iomdina E.N., Sergeeva M.G., Zernii E.Yu. Comparative lipidomic analysis of inflammatory mediators in the aqueous humor and tear fluid of humans and rabbits. Metabolomics, 2020, 16(2), 27.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: Объектом исследования являются белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы. Целью работы является поиск регуляторов, позволяющих модулировать функциональные свойства белков, ферментов, полиферментных комплексов и рецепторных систем, разработка прототипов лекарственных средств. В 2021 году были получены важные результаты по разработке методов исследования и изучению путей регуляции биологических систем разного уровня организации: белков, ферментов, полиферментных комплексов и рецепторных систем. Продолжена работа по разработке новых подходов для исследования и характеристики взаимосвязи между структурой и функциональными свойствами белков/ферментов, реализованных в виде многослойной биоинформатической платформы, позволяющей идентифицировать ранее неизвестные функциональные свойства белков/ферментов и проводить поиск белков/ферментов с заданной функцией в базах данных последовательностей и структур белков. Разработка новых методов и подходов для биоинформатического анализа суперсемейств продолжена на уровне 3D-структур с использованием параллельных вычислений и подходов машинного обучения. Анализ организации локальной 3D-структуры основной цепи реализован в программе Zebra3D и дополнен анализом ориентации боковых цепей аминокислот. Биоинформатический анализ на уровне трехмерной организации основной и боковой цепи остатков, а также аминокислотных последовательностей использован для изучения детерминант функционального разнообразия в суперсемействах нейраминидаз GH34, α/β-гидролаз, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназ, D,D-карбоксипептидаз. Созданный набор инструментов биоинформатики реализован с использованием современных высокопроизводительных вычислительных средств и представлен в виде публичной вебплатформы в сети интернет с доступом к ресурсу для широкого круга пользователей в виде 11 онлайн серверов. Проведен сравнительный анализ ингибирующего действия фосфоновых аналогов 2-оксокислот на 2-оксоглутаратдегидрогеназу и одну из ее изоформ - 2-оксоадипатдегидрогеназу, показано, что фосфоновые аналоги 2-оксоглутаровой и 2-оксопимелиновой кислоты преимущественно блокируют активные центры 2-оксоглутаратдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы, соответственно. Построены модели комплексов 2-оксоглутаратдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы с фосфоновыми аналогами 2-оксоглутарата, 2-оксоадипата и 2-оксопимелата, определены аминокислотные остатки активных центров, определяющие селективное связывание фосфоновых аналогов. Продолжено исследование топологии и роли дисульфидных связей в суперсемействе Ntn-гидролаз, получены продуценты мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli bA153C+bK172C, bK146C+bA174C и bT307C+bV320C. Показано, что наиболее существенный эффект стабилизации фермента обнаружен для мутантной формы bT307C+bV320C. Наряду со стабилизацией пенициллинацилазы при введении остатков, способных образовать дисульфидные связи, обнаружена стабилизация нативного фермента и его мутантов в присутствии окисленного глутатиона. Проведено молекулярное моделирование связывания субстратов, конформационного перехода кофактора, полуреакции окисления в механизме действия 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназы из Pseudomonas azelaica, действия мембранной цинк-зависимой металлопротеазы человека ZMPSTE24, поиск ингибиторов ZMPSTE24, транскетолазы, лактатдегидрогеназы А и тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1, поиск новых путей регуляции функциональных свойств нейраминидазы NanА как ключевого фермента патогенеза Streptococcus pneumoniae. Исследованы клеточные ответы нейтрофилов и время жизни нейтрофилов в зависимости от соотношения бактериальных клеток и нейтрофилов, а также других медиаторов воспаления. Установлено, что пептиды GKY25 и GKY20 ингибируют действие липополисахаридов на синтез лейкотриенов в нейтрофилах, отменяют ингибирующее действие LPS на апоптоз нейтрофилов, а LPS и бактерии Salmonella typhimurium ингибируют спонтанный апоптоз нейтрофилов, что способствует затяжным воспалительным процессам. Изучена роль амилоидной трансформации a-синуклеина в нарушении гликолиза при синуклоинопатиях. Показано, что увеличение концентрации субстрата глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) - глицеральдегид-3-фосфата - приводит к снижению активности этого фермента в результате его гликирования: продуктом гликирования фермента является гидроксиимидазолон, образующийся в результате модификации аргининовых остатков. Еще одним следствием гликирования ГАФД является блокирование системы шаперонов, вызывающее замедление скорости роста клеток. Изучено влияние низкомолекулярных тиолов на активность ГАФД и их способность предотвращать гликирование фермента альдегидами. Показано, что низкомолекулярные тиолы (бета-меркаптоэтанол и дитиотреитол) в миллимолярных концентрациях предотвращают гликирование ГАФД, а также ее модификацию под действием активных форм кислорода. Предложено несколько синтетических соединений, содержащих сульфгидрильную группу и обладающих избирательным взаимодействием с ГАФД. В клеточных моделях изучены эффекты ингибиторов ферментов липоксигеназ (5-липоксигеназа, 12-липоксигеназа) на профиль синтезируемых астроцитами оксилипинов. В модели взаимодействия нейронов и астроцитов изучены цитотоксические эффекты липидных фракций, выделяемых астроцитами в ответ на активацию Толл-подобных рецепторов, и показана потенциальная возможность нейропротекторных эффектов у тестируемых ингибиторов. Измерения профилей окисленных метаболитов жирных кислот выявили эффекты толерантности астроцитов к стимуляции Толл-подобных рецепторов в модели повышенной концентрации глюкозы и сдвиг профиля синтезируемых оксилипинов в сторону провоспалительного состояния с активацией циклооксигеназного пути биосинтеза производных арахидоновой кислоты. Результаты проведенных исследований опубликована 21 статья в международных журналах, индексируемых базах Wos, Scopus и РИНЦ, получен патент, сделано 10 докладов на российских и международных конференциях. Защищены 3 кандидатские диссертации (Гущина И.В., Мельникова А.К. и Шарапова Я.А.), 4 дипломных и 7 курсовых работ.
4 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: В 2022 году получены важные результаты по изучению возможностей регуляции функционирования биологических систем разного уровня организации. Подходы, разработанные нами ранее, были применены для изучения действия отдельных белков и молекулярного моделирования реакций, катализируемых 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназой из Pseudomonas azelaica, поли(АДФ-рибозо)полимеразой 1 человека и пенициллинацилазой из Е.coli. Охарактеризованы стадии связывания NADH, взаимодействия NADH/FAD, а также сопутствующие конформационные изменения 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназы, показано формирование индуцированного кармана для никотинамидного кольца, в котором тройное стэкинг-взаимодействие никотинамидного, а также изоаллоксазинового колец с остатками активного центра фермента стабилизирует комплекс с переносом заряда, определяет стереоспецифичность Pro-S переноса гидрида и низкий энергетический барьер. Показано, что образующийся анион ФАДН- подвергается конформационному переходу изоаллоксазинового кольца, сопровождаемому связыванием молекулы кислорода. При моделировании каталитического механизма действия поли(АДФ-рибозо)полимеразы выбрана оптимальная молекулярная система, проведена симуляция молекулярно-динамических траекторий поведения фермент-субстратного комплекса в микросекундном диапазоне. Установлен путь доставки нуклеофила в активный центр пенициллинацилазы, охарактеризована роль аминокислотных остатков Arg145 и Arg263 в ориентации молекулы нуклеофила, обнаружено образование промежуточного непродуктивного комплекса ацилфермент-нуклеофил с участием Arg145 для синтеза с переносом ацильной группы на ядро пенициллинов. Выявлены остатки, участвующие в связывании и доставке 6-аминопенициллановой кислоты в активный центр фермента, определены точки мутации в структуре фермента с целью улучшения его синтетической активности. Исследованы возможности создания мутантных форм пенициллинацилазы, способных превращать производные жирных кислот, рекомендованы три мутанта (bI177A, bW154A и bW154A+bI177A) для экспериментального изучения. Проведен компьютерный скрининг ингибиторов вируса гриппа нового поколения, отобраны молекулы для экспериментального изучения. Показано, что пенициллинацилаза и ее мутанты могут обладать β-лактамазной активностью. Продолжено изучение воздействия на организм противоопухолевого ингибитора 7-метилгуанина, разработана методика тестирования ингибиторной активности по отношению к поли(ADP-рибозо)полимеразе, основанная на применении пермеабилизированных клеток кардиомиоцитов и нейронов. Разработаны методы определения и синтеза альфа-кетоглутарамата для использования в качестве субстрата при определении активности омега-амидазы и стандарта для хроматографического анализа. Важные результаты получены при исследовании механизмов и возможностей регуляции биологических систем более высокого уровня организации. Исследовано действие хемотактических пептидов на активацию синтеза лейкотриенов в фагоцитирующих нейтрофилах при взаимодействии с бактериями Salmonella typhimurium, результатом которого является увеличение синтеза лейкотриена В4, обнаружено, что при большой бактериальной нагрузке подавляется трансформация лейкотриена В4 в неактивный продукт. Впервые охарактеризовано ингибирование синтеза лейкотриенов в нейтрофилах при действии митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1. Обобщены данные по влиянию низкомолекулярных ингибиторов на активацию синтеза оксилипинов и цитокинов, in vitro показаны потенциальные механизмы окисления липидного бислоя клетки, проведен анализ продуктов окисления. Систематизированы данные по однонуклеотидным заменам генов врожденного иммунитета и биосинтеза оксилипинов при онкологических и неврологических заболеваниях. Проведен анализ профиля оксилипинов в животных моделях крыс с ограниченным поступлением субстратов, полиненасыщенных жирных кислот. На примере рака молочной железы показано, что разработанные подходы к анализу жирных кислот применимы для анализа плазмы человека. Проведена оценка роли сигнальных липидов оксилипинов в патогенезе глаукомы человека. Доказано, что производные коричной кислоты обладают антиамилоидной активностью в отношении альфа-синуклеина. При изучении влияния различных типов шаперонинов на амилоидную трансформацию прионного белка и альфа-синуклеина показано, что в зависимости от функционального состояния шаперонины могут предотвращать амилоидную трансформацию белков или препятствовать ей. Изучена структура шаперонинов и их комплексов с амилоидогенными белками. Продолжено исследование влияния S-нитрозилирования и окисления каталитически важных остатков цистеина на функции и белок-белковые взаимодействия гликолитических ферментов и амилоидогенных белков. Доказано, что такая модификация дестабилизирует гликолитические ферменты и уменьшает их каталитическую активность. Подтверждены гипотезы о роли окиси азота в индукции апоптоза. Доказано, что модификация амилоидного белка приона окисью азота предотвращает его амилоидную трансформацию, но не препятствует агрегации. Показана применимость разработанного способа количественного определения НАД+ в мозге крыс для анализа крови человека. Показано снижение содержания НАД+ в крови кардиологических и неврологических пациентов, свидетельствующее о диагностическом значении данного метаболического индикатора. По результатам исследований в 2022 году опубликовано 26 статей, получен патент, сделано 14 докладов на российских и международных конференциях, защищены 3 кандидатские диссертации, 4 дипломные и 8 курсовых работ.
5 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: Проведен анализ взаимосвязи ферментов энергетического обмена глюкозы и генов метаболизма оксилипинов как подмножества генов системы врожденного иммунитета для заболеваний, связанных с повышенным содержанием глюкозы в крови. Показано, что профиль оксилипинов может являться маркером тяжести протекания болезни Паркинсона (Чистяков и др. 2023а). Определена характеристика профиля производных полиненасыщенных жирных кислот в биологических образцах в контексте повреждения сетчатки у пациентов и в модельных экспериментах на животных (Бакшеева и др., 2023). Проведен обзор данных для выявления потенциальных регуляторов биологических процессов на основе использования дейтерированных производных полиненасыщенных жирных кислот (Бренна и др. 2023). Проведено обобщение информации получаемой из профилей плазмы методами липидомики с фокусом на оксилипины при сборе информации у различных онкологических больных (Чистяков и др. 2023б). Разрабатываемые подходы позволяют выявлять потенциальные регуляторы биологических процессов на основе данных липидомики и транскриптомики в рамках полиферментных систем биосинтеза оксилипинов и внутриклеточных сигнальных систем активации толл-подобных рецепторов и других стимулов, участников воспалительных процессов. Проведено количественное определение низкомолекулярных регуляторов ферментов у пациентов и контрольной группы для характеристики роли этих регуляторов в диагностике и терапии кардиологических и неврологических заболеваний, определены средние уровни и вариабельность низкомолекулярных регуляторов ферментов у кардиологических и неврологических пациентов и в контрольной группе и оценена достоверность различий между группами. Разработана процедура пробоподготовки крови для оптимальной экстракции содержащегося в крови тиаминдифосфата (ТДФ). Отработана методика измерения экстрагированного ТДФ крови человека, основанная на определении активности апофермента дрожжевой транскетолазы после его насыщения коферментом ТДФ, экстрагированным из крови (статья отправлена в печать). При сравнении тиаминового статуса патологий и контролей использованы выборки одного возрастного интервала. Изучены образцы крови, принадлежащей контрольной группе и группе пациентов с генетически обусловленной нейропатией Шарко-Мари-Тута (возрастная группа 18-70 лет), возникающей при мутациях различных генов, в том числе затрагивающих метаболизм, зависящий от тиамина (витамина В1). Изменения тиаминового статуса по содержанию ТДФ крови и росту ТДФ после введения витамина В1 у пациентов не обнаружены. Однако у пациентов показан терапевтический эффект введения витамина В1 (тиамина) или его фармакологической формы (сульбутиамин). Возрастание в крови коферментной формы тиамина – ТДФ – сопровождалось увеличением силы сгибателей пальцев рук, измеряемой с помощью динамометра. В 2023 г. дано теоретическое обоснование терапевтического эффекта тиамина (витамина В1) у больных с синдромом Шарко-Мари-Тута (Буник 2023). Достижения и практическая значимость предлагаемых подходов многократно обсуждались с врачами Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского (МОНИКИ), в кооперации с которыми проведены медицинско-ориентированные исследования. Подтверждено положительное действие ежедневного приема фармакологических доз (100 мг в день) тиамина у пациентов, причем терапевтический эффект наблюдали как у отдельных пациентов, так и в виде достоверных корреляций между содержанием в крови основного биологического производного витамина (тиаминдифосфата) и мышечной силой, которая у пациентов с синдромом Шарко-Мари-Тута значительно понижена (у некоторых менее 30% от нормы). У кардиологических больных (возрастная группа 42-80 лет) показаны гендерные различия в уровнях ТДФ по сравнению с контрольной группой: у кардиопациентов-мужчин ТДФ не снижается, тогда у кардиопациентов-женщин ТДФ в крови падает. Из других показателей тиаминового статуса в крови человека исследовали иммунохимическое определение 2-оксоадипатдегидрогеназы (ОАДГ) (Алешин и др. 2023а). Показано, что результаты определения сильно зависят от пробоподготовки. При метанол-уксусной экстракции крови и последующем растворении белкового осадка наблюдалось снижение экспрессии ОАДГ. Сравнение кардиопациентов с хирургическим вмешательством и без такового показало рост ОАДГ в крови последних по сравнению с первыми (статья отправлена в печать). В отчетном году получены важные результаты по молекулярным механизмам действия тиамина (витамина В1) и биохимическим маркерам такого действия (Вейдингер и др. 2023). При эффективном взаимодействии с врачами удалось внедрить в медицинскую практику разработанные методы терапии и диагностики. Одной из задач в отчетном году было исследование фагоцитоза, синтеза лейкотриенов, апоптоза нейтрофилов при различных бактериальных нагрузках, что позволило бы лучше понять, как уровень бактериальной нагрузки влияет на клеточные функции нейтрофилов человека. На экспериментальной модели взаимодействия нейтрофилов с бактериями Salmonella typhimurium изучено действие оксидантов и антиоксидантов на клеточные функции нейтрофилов, подготовлена к печати статья “Redox Processes are Major Regulators of Leukotriene Synthesis in Neutrophils exposed to Bacteria Salmonella typhimurium; the Way to manipulate Neutrophil Swarming”, в которой показано, что агенты, влияющие на баланс окисленного и восстановленного глутатиона в клетке сильнейшим образом влияют на синтез лейкотриена В4, и окисляющие вещества (диамид), либо антиоксиданты (SkQ1) усиливают либо уменьшают продукцию этих физиологически активных веществ, важных для роения нейтрофилов к микробным кластерам. Нейтрофилы участвуют в подавлении микробной инфекции, фагоцитируя и разрушая чужеродные объекты с использованием целого арсенала цитолитических продуктов, включая протеазы и активные формы кислорода и азота. Физиологические функции нейтрофилов включают также минимизацию неспецифического повреждения клеток и тканей этими реагентами и индукцию собственной своевременной гибели путем апоптоза. Синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН) с неметилированными мотивами CpG имитируют бактериальные фрагменты ДНК и обладают рядом иммуномодулирующих свойств. Синтетические CpG-ОДН – перспективные компоненты иммуномодулирующих препаратов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Фосфоротиоатная модификация стабилизирует эти соединения, способствуя достижению клинического эффекта, но при этом изменяет их иммуномодулирующие свойства. Показано, что фосфоротиоатные связи определяют выраженный неспецифический прооксидантный эффект CpG-ОДН на нейтрофилы, а усиление синтеза оксида азота под действием CpG олигонуклеотидов класса А строго зависит от наличия CpG мотивов и палиндромных элементов вторичной структуры – шпилек (Голенкина и др. 2023). Изучена взаимосвязь активности спермоспецифической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и подвижности сперматозоидов, несущих Х-хромосому (Kapitonova et al., 2023), а также проверена возможность использовать особенности энергетического обмена сперматозоидов для их разделения на клетки с Х- и У-хромосомами (Поздышев и др. 2023). Продолжено исследование влияния разных типов шаперонинов на патологическую трансформацию амилоидогенных белков, участвующих в развитии нейродегенеративных заболеваний. Установлено, что вирусные шаперонины в функционально активном состоянии стимулируют фибриллизацию прионного белка (Leisi et al., 2023). Предложена гипотеза, согласно которой микроорганизмы желудочно-кишечного тракта участвуют в возникновении и развитии нейродегенеративных заболеваний (Muronetz et al., 2023), причем шаперонины микроорганизмов и бактериофагов могут принимать участие в этих процессах. Особую роль шаперонины микробиоты могут играть в проникновении патологических форм амилоидных белков из желудочно-кишечного тракта в центральную нервную систему (Leisi et al., 2023, Muronetz et al., 2023). Получены новые данные о структуре эукариотического шаперонина TRiC/CCT, также участвующего в патологической трансформации амилоидных белков (Станишнева-Коновалова и др., 2023). Продолжено изучение взаимодействия ферментов энергетического обмена с РНК, а также влияние такого типа взаимодействий на свойства этих ферментов. В пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae обнаружено присутствие комплекса фермента гексокиназы с РНК. Гексокиназа в составе комплекса сохраняла свою каталитическую активность, а РНК, состоящая 42 нуклеотидов с молекулярной массой около 14,5 кДа, обладала активностью глюкозофосфатизомеразы. Показано, что РНК является рибозимом и катализирует взаимопревращение глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата. Определены каталитические параметры обнаруженного рибозима: Km и Vmax составляют, соответственно, 0,14 ± 0,02 мМ и 14 ± 1,3 Е/мг для глюкозо-6-фосфата и 0,2 ± 0,03 мМ и 15,4 ± 1,4 Е/мг для фруктозо-6-фосфата. Кинетические характеристики были практические идентичны у свободного и связанного с гексокиназой рибозима. Возможные преимущества образования комплекса фермента и рибозима заключаются в том, что продукты гексокиназной реакции непосредственно используются рибозимом, не выделяясь в среду (Соловьева, 2023). Продолжено изучение каталитического механизма действия транскетолазы. Впервые показано непосредственное участие молекулы воды в каталитическом акте, катализируемом этим ферментом. С использованием метода масс-спектрометрии установлено, что после связывания тиаминдифосфата с транскетолазой и последующего превращения образуется молекула тиаминдифосфата с массой, увеличенной на одну молекулу кислорода. При фрагментации этого соединения образуется молекула тиаминдифосфата с массой, уменьшенной на 1 и 2 атома водорода, то есть отщепляется HO и H2O. На основании этих данных предположено, что после образования холотранскетолазы вода ковалентно связывается с тиаминдифосфатом, а карбанион образуется в результате ее отщепления. Также показано участие молекулы воды в катализе односубстратной транскетолазной реакции (Solovjeva, 2023). Проведен компьютерный скрининг библиотеки низкомолекулярных соединений с целью поиска ингибиторов транскетолазы из Mycobacterium tuberculosis, отобраны наиболее перспективные соединения, при экспериментальном исследовании подтверждена их способность подавлять рост патогенных бактерий (Гущина и др. 2023). Изучена способность пенициллинацилазы проявлять мунлайтинговую бета-лактамазную активность. Задача заключалась в том, что при промышленном производстве ядер пенициллинов и цефалоспоринов – 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот, а также ферментативном получении полусинтетических бета-лактамных антибиотиков на основе этих ядер, наблюдается образование побочных продуктов разрушения бета-лактамного кольца, и надо было выяснить, не являются ли такие побочные процессы проявлением мунлайтинговой активности пенициллинацилазы. На потенциальную возможность протекания таких неспецифических свойств фермента указывало открытие целого ранее неизвестных участков связывания низкомолекулярных соединений в структуре пенициллинацилазы, Функциональная роль которых была непонятна. Поиск комплементарных лигандов/модуляторов показал, что бензилпенициллин действительно может связываться на одном из таких участков, однако дальнейшее его превращение по типу бета-лактамазной реакции крайне маловероятна. Таким образом выявленный участок связывания в структуре пенициллинацилазы может быть ответственен за ингибирование фермента субстратом при производстве ядер бета-лактамных антибиотиков, но не за протекание побочного разрушение бета-лактамного цикла. Дальнейшие исследования при помощи молекулярного моделирования показали, что потенциальной бета-лактамазной активностью могут обладать мутанты пенициллинацилазы из Escherichia coli. Соответствующие мутанты фермента были получены, экспериментальная проверка показала, что бета-лактамазная активность, если и имеет место, является очень низкой и соизмеримой со спонтанным разложением соединений и/или микробиологическим загрязнением экспериментального раствора. Таким образом установлено, что мунлайтинговая активность пенициллинацилазы не является ответственной за побочные превращения бета-лактамных соединений, для уменьшения их вклада необходимо строго следить за возможностью микробного заражения, а также свести к минимуму вклад спонтанных реакций, например, за счет увеличения скорости целевых биокаталитических стадий при использовании наиболее активного биокатализатора или увеличении его концентрации (т.е. оптимизации кинетики целевого превращения). Проведено молекулярное моделирование механизма действия мембранной цинк-зависимой металлопротеазы человека ZMPSTE24, выбор наиболее перспективных ингибиторов ZMPSTE24 для экспериментального изучения. Структурная организация и механические характеристики ядер играют чрезвычайно важную роль в функционировании эукариотических клеток, включая миграцию раковых клеток, ключевое значение при этом имеет процессинг преламина А под действием мембранной цинк-зависимой металлопротеазы ZMPSTE24. В результате ZMPSTE24-катализируемого протеолиза во время созревания ламин А теряет свой фарнезилированный С-концевой хвост, который, как предполагается, необходим для нацеливания ламинов на внутреннюю ядерную мембрану. Подавление активности ZMPSTE24 небольшими молекулами может привести к накоплению преламина и ингибированию метастатической активности рака. В отчетном году нами установлен механизм ингибирования ZMPSTE24 лопинавиром (известным ингибитором протеазы ВИЧ), действие которого на ZMPSTE24 было обнаружено ранее, однако ни участок связывания лопинавира, ни пути образования комплекса фермента с лигандом не были известны. Эта информация была необходима для того, чтобы, выяснив место локализации этого соединения в структуре ZMPSTE24, можно было вести поиск более эффективных ингибиторов. Используя протокол метадинамики in silico, исследовано проникновение лопинавира во внутреннюю полость ZMPSTE24 и его связывание с ферментом, что дало возможность сканировать всю поверхность белка. Выяснение способа связывания и пути проникновения лопинавира в активный центр фермента позволило определить ключевые физико-химические критерии для поиска новых соединений-лидеров. В результате компьютерного скрининга баз данных PubChem и MMPI выявлены четыре соединения, способные проходить через канал доставки, связываться в активном центре и потенциально превосходящие лопинавир по эффективности ингибирования ZMPSTE24: батимастат, FM59390, фозиноприлат и зофеноприлат. Используя МТТ-тест и вестерн-блоттинг, мы экспериментально подтвердили, что фозиноприлат является наиболее эффективным агентом, приводящим к накоплению преламина А в клеточных моделях. На основании полученных результатов в печать отправлена статья «Identification of potent and selective inhibitors of the human zinc metalloproteinase ZMPSTE24». Продолжено изучение воздействия на организм обнаруженного нами ранее противоопухолевого ингибитора 7-метилгуанина поли(АДФ-рибозо)полимеразы (ПАРП), его метаболитов и структурных аналогов. Осуществлена отработка методики тестирования их цитопротекторных свойств при остром окислительном стрессе на модели кардиомиобластов крысы. В частности, осуществлены предварительные эксперименты по измерению ингибиторной активности новых производных 7-метилгуанина в отношении ПАРП на пермеабилизованных клетках, идентифицированы потенциально более эффективные ингибиторы (Шрам и др. 2023). Проведен сравнительный компьютерный анализ их взаимодействий с изоформами ПАРП-1 и ПАРП-2 с применением различных моделей, включающих как полноразмерный белок, так и структуры изолированных каталитических доменов, представленных в Protein Data Bank. Было также проведено изучение взаимосвязи структуры и функции для двух белков - цитохрома с (Zamakhov et al., 2023) и пирофосфатазы Chertkova et al., 2023) Разработан метод определения альфа-кетометилселенобутирата - ранее недооцененного физиологически активного метаболита природной аминокислоты L-селенометионина, проведен ферментативный синтез L-селенометионина, получены высокоочищенные препараты соединения для использования в качестве перспективного лекарственного средства, а также стандарта для хроматографического анализа (Никулин и др. 2023). Отдельная тема исследований касалась использования синтетических и природных полимеров для создания систем доставки биомолекул в клетки-мишени с целью создания новых препаратов, которые могут применены в качестве лечебных средств, в частности, для лечения онкологических заболеваний (Blagodatskikh et al., 2023, Grinberg et al., 2023, Spiridonov et al., 2023a, Spiridonov et al., 2023b, Yaroslavov et al., 2023). По результатам исследований в 2023 году опубликованы 29 статей, сделано 13 докладов на российских и международных конференциях, защищены 2 кандидатские диссертации, 3 дипломные и 4 курсовые работы. Список публикаций 1. Golenkina E.A., Galkina S.I., Viryasova G.M., Sud’ina G.F. The Pro-Oxidant Effect of Class A CpG ODNs on Human Neutrophils Includes Both Non-Specific Stimulation of ROS Production and Structurally Determined Induction of NO Synthesis. Oxygen. 2023, 3, 20–31. https://doi.org/10.3390/oxygen3010002. 2. Weidinger A., Milivojev N., Hosmann A., Duvigneau J.C., Szabo C., Törö G., Rauter L., Vaglio-Garro A., Mkrtchyan G.V., Trofimova L., Sharipov R.R., Surin A.M., Krasilnikova I.A., Pinelis V.G., Tretter L., Moldzio R., Hülya B., Kagan V.E., Bunik V.I., Kozlov A.V. Oxoglutarate dehydrogenase complex controls glutamata-mediated neuronal death. Redox Biology, 2023, том 62, с. 1-15 DOI: 10.1016/j.redox.2023.102669 3. Bunik V.I. Editorial: Experts' opinion in medicine 2022, Frontiers in Medicine, 2023,том 10, с. 1-3 DOI: 10.3389/fmed.2023.1296196 4. Bunik V. The Therapeutic Potential of Vitamins B1, B3 and B6 in Charcot–Marie–Tooth Disease with the Compromised Status of Vitamin-Dependent Processes. Biology, и2023, том 12, № 7, с. 1-16. https://doi.org/10.3390/biology12070897 5. Aleshin VA, Sibiryakina DA, Kazantsev AV, Graf AV, Bunik VI. 2023. Acylation of the Rat Brain Proteins is Affected by the Inhibition of Pyruvate Dehydrogenase in vivo. Biochemistry (Moscow), Pleiades Publishing, Ltd (Road Town, United Kingdom), том 88, № 1, с. 105-118. http://dx.doi.org/10.1134/S0006297923010091 6. Aleshin V.A., Bunik V.I. Protein–Protein Interfaces as Druggable Targets: A Common Motif of the Pyridoxal-5′-Phosphate-Dependent Enzymes to Receive the Coenzyme from Its Producers. Biochemistry (Moscow), 2023, том 88, № 7, с. 1022-1033. http://dx.doi.org/10.1134/s0006297923070131. Алешин В.А., Буник В.И. Белок-белковые интерфейсы как мишени лекарств: общий для пиридоксаль-5′-фосфат-зависимых ферментов мотив для получения кофермента от его продуцентов. Биохимия, 2023, том 88, №7, с.1254-1267. DOI: 10.31857/S0320972523070138 7. Aleshin V.A., Graf A.V., Artiukhov A.V., Ksenofontov A.L., Zavileyskiy L.G., Maslova M.V., Bunik V.I. Pentylenetetrazole-Induced Seizures Are Increased after Kindling, Exhibiting Vitamin-Responsive Correlations to the Post-Seizures Behavior, Amino Acids Metabolism and Key Metabolic Regulators in the Rat Brain. International Journal of Molecular Sciences, 2023, том 24, № 15, с. 1-30. http://dx.doi.org/10.3390/ijms241512405 8. Nikulin M.V., Drobot V.V., Shurubor Y.I., Švedas V.K., Krasnikov B.F. Preparative Biocatalytic Synthesis of α-Ketomethylselenobutyrate—A Putative Agent for Cancer Therapy. Molecules, 2023, том 28, № 17, 6178. DOI: 10.3390/molecules28176178 9. Гущина И.В., Нилов Д.К., Щербакова Т.А., Балдин С.М., Швядас В.К. Поиск ингибиторов транскетолазы из Mycobacterium tuberculosis в ряду сульфозамещенных соединений. Acta Naturae , 2023, том 15, № 2, с. 81-83. DOI: 10.32607/actanaturae.15709 10. Шрам С.И., Щербакова Т.А., Абрамова Т.В., Барадиева Э.Ц., Ефремова А.С., Смирновская 11. М.С., Сильников В.Н., Швядас В.К., Нилов Д.К. Природные производные гуанина оказывают PARP-ингибиторное и цитопротекторное действие на модели повреждения кардиомиоцитов при окислительном стрессе. (2023) Биохимия, 88, 962-972; DOI: 10.1134/S0006297923060068 12. Blagodatskikh I.V., Vyshivannaya O.V., Tishchenko N.A.; Orlov V.N., Tikhonov V.E., Bezrodnykh E.A., Ezernitskaya M.A., Khokhlov A.R. Complexation between chitosan and carboxymethyl cellulose in weakly acidic, neutral, and weakly alcaline media. // International Journal of Biological Macromolecules, 243 (2023), 125277. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.125277 13. Grinberg V.Y., Burova T.V., Grinberg N.V., Dubovik A.S., Tikhonov V.E., Moskalets A.P., Orlov V.N., Plashchina I.G., Khokhlov A.R. Chitosan polyplexes: Energetics of formation and conformational changes in DNA upon binding and release. // International Journal of Biological Macromolecules, 250 (2023), 126265. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.126265 14. Chertkova R.V., Oleynikov I.P., Pakhomov A.A., Sudakov R.V., Orlov V.N., Semenova M.A., Arutyunyan A.M., Ptushenko V.V., Kirpichnikov M.P., Dolgikh D.A., Vygodina T.V. Mutant Cytochrome C as a Potential Detector of Superoxide Generation: Effect of Mutations on the Function and Properties // Cells, 2023, 12(18), 2316; https://doi.org/10.3390/cells12182316 15. Zamakhov I.M., Anashkin V.A., Moiseenko A.V., Orlov V.N., Vorobyeva N.N., Sokolova O.S., Baykov A.A. The Structure and Nucleotide-Binding Characteristics of Regulated Cystathionine β-Synthase Domain-Containing Pyrophosphatase without One Catalytic Domain // Int.J.Mol.Sci., 2023, 24(24), 17160. https://doi.org/10.3390/ijms242417160 16. Kapitonova A.A., Muronetz V.I., Pozdyshev D.V. Sorted Bulls' X-Chromosome-Bearing Spermatozoa Show Increased GAPDHS Activity Correlating with Motility. Genes (Basel). 2023,14(1):235. doi: 10.3390/genes14010235. 17. Leisi E.V., Moiseenko A.V., Kudryavtseva S.S., Pozdyshev D.V., Muronetz V.I., Kurochkina L.P. Bacteriophage-encoded chaperonins stimulate prion protein fibrillation in an ATP-dependent manner. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 2023, 1872 (1):140965. doi: 10.1016/j.bbapap. 18. Muronetz V.I., Kurochkina L.P., Leisi E.V., Kudryavtseva S.S. Are gastrointestinal microorganisms involved in the onset and development of amyloid neurodegenerative diseases? Microbiology research, 2023,14, 1942-1955, DOI: 10.3390/microbiolres14040131. 19. Spiridonov V., Zoirova Z., Alyokhina Y., Perov N., Afanasov M., Pozdyshev D., Krjukova D., Knotko A., Muronetz V., Yaroslavov A. Magnetically Controlled Hyaluronic Acid-Maghemite Nanocomposites with Embedded Doxorubicin. Polymers (Basel). 2023,15(17):3644. doi: 10.3390/polym15173644. 20. Spiridonov V.V., Lukmanova A.R., Pozdyshev D.V., Markova A.A., Volodina Y.L., Golovina G.V., Shakhmatov V.V., Kuzmin V.A., Muronetz V.I., Yaroslavov A.A. Ionically cross-linked micro-sized hydrogels with encapsulated drug: Structure, cell uptake kinetics and cytotoxicity. Mendeleev Communications, 2023, 33 (4) 553-555. DOI: 10.1016/j.mencom.2023.02.023. 21. Solovjeva O.N. New Role of Water in Transketolase Catalysis. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24(3), 2068. doi.org/10.3390/ijms24032068 22. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Abramova T.A., Pozdyshev D.V., Muronetz V.I. Multi-compartment containers from a mixture of natural and synthetic lipids. Mendeleev Communications, 2023, 33, 221-224 DOI https://doi.org/10.1016/j.mencom.2023.02.023 23. Поздышев Д.В., Комбарова Н.А., Муронец В.И. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ СПЕРМАТОЗОИДОВ, НЕСУЩИХ X- ИЛИ Y-ХРОМОСОМУ, ДЛЯ ИХ РАЗДЕЛЕНИЯ НА КЛЕТКИ ОДНОГО ТИПА, Биохимия, 2023, 88 (5), 803-816. DOI: 10.31857/S0320972523050081 24. Соловьева О.Н. Новый комплекс рибозима с глюкозо-6-фосфатизомеразной активностью и фермента гексокиназы в пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Биоорганическая химия, 2023, 49, 5, 494-501. https://doi.org/10.31857/S013234232305007X. 25. Станишнева-Коновалова Т.Б., Пичкур Е.Б., Кудрявцева С.С., Ярошевич И.А., Семенов А.Н., Максимов Е.Г., Моисеенко А.В., Волох О.И., Муронец В.И. Структура бычьего шаперонина TRiC/CCT в открытой конформации по данным криоэлектронной микроскопии. Вестник Московского университета. Серия 16: Биология, 2023, 78, № 3S, 40-46 DOI: 10.55959/MSU0137-0952-16-78-3S-7. 26. Brenna J.T., Sergeeva M.G., Pestov N.B., Korneenko T.V., Shchepinov M.S. Arachidonic Acid: Reconciling the Dichotomy of its Oxidative Cascade through Specific Deuteration. Free Radical Research, 2023, с. 1-16. DOI: 10.1080/10715762.2023.2277145 27. Chistyakov D.V., Kovalenko L.V., Donnikov M.Y., Sergeeva M.G. Blood Oxylipin Profiles as Markers of Oncological Diseases. в журнале Biochemistry (Moscow), 2023, том 88, № 5, с. 621-629. DOI: 10.1134/s000629792305005x. Чистяков Д.В., Коваленко Л.В., Донников М.Ю., Сергеева М.Г. Профили оксилипинов в крови как маркеры патогенеза онкологических заболеваний. Биохимия, 2023 , том 88, № 5, с. 761-772. DOI: 10.31857/S0320972523050056 28. Chistyakov D.V., Azbukina N.V., Lopachev A.V., Goriainov S.V., Astakhova A.A., Ptitsyna E.V., Klimenko A.S., Poleshuk V.V., Kazanskaya R.B., Fedorova T.N., Sergeeva M.G. Plasma oxylipin profiles reflect Parkinson's disease stage. Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 2023. DOI: 10.1016/j.prostaglandins.2023.106788 29. Baksheeva V.E., Tiulina V.V., Iomdina E.N., Petrov S.Yu, Filippova O.M., Kushnarevich N.Yu, Suleiman E.A., Eyraud R., Devred F., Serebryakova M.V., Shebardina N.G., Chistyakov D.V., Senin I.I., Mitkevich V.A., Tsvetkov P.O., Zernii E.Yu. Tear nanoDSF Denaturation Profile Is Predictive of Glaucoma. International Journal of Molecular Sciences, 2023, том 24, № 8. DOI: 10.3390/ijms24087132
6 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: Исследование механизмов функционирования биологических систем: белков, ферментов, полиферментных комплексов и рецепторов, а также поиск подходящих соединений для модуляции их функциональных свойств является чрезвычайно важным для современной биологии и медицины как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. В 2024 году были продолжены исследования путей регуляции биологических систем разного уровня организации. Определен профиль оксилипинов и получена оценка возможности их направленного изменения как in vitro экспериментах (активация Толл-подобного рецептора 3 TLR3 в клеточной модели нейровоспаления), так и in vivo экспериментах в моделях аутоиммунного увеита и инсульта. Понимание ключевых элементов сигнальных каскадов и ферментативных превращений биосинтеза оксилипинов при различных внешних воздействиях на клетку или организм должно помочь установить возможные терапевтические мишени для направленного воздействия. Изучено координированное поведение нейтрофилов в процессе роения, регулируемого различными медиаторами и межклеточными взаимодействиями, влияние синтезируемого нейтрофилами лейкотриена В4 – сильнейшего хемоаттрактанта, участвующего в привлечении дополнительного количества нейтрофилов к месту инфекции. Целью исследований было понять механизмы регуляции синтеза лейкотриенов под действием бактерий и различных молекулярных структур, ассоциированных с патогенами. Исследованы возможности регуляции метаболизма ингибиторами тиаминового транспорта и тиаминдифосфат(ТДФ)-зависимых ферментов. Изучена роль пост-трансляционных модификаций, в частности нитрозилирования, окисления и гликирования, в регуляции каталитической активности глицеральдегид-3-фосфатдегидогеназы, а также в развитии патологических процессов. Проведен поиск новых комплексов ферментов с РНК и изучение влияния нуклеиновых кислот на каталитические и регуляторные свойства ферментов. Проведено сравнение влияния разных типов вирусных шаперонинов на патологическую трансформацию альфа-синуклеина и прионного белка. Изучены структурные особенности амилоидных структур, образующихся при трансформации амилоидных белков в разных условиях, с помощью методов крио-микроскопии и малоуглового рентгеновского рассеяния. Оценена эффективность использования синтетических и природных полимеров в качестве средств направленной доставки лекарственных соединений. Разработаны и апробированы новые подходы генерации библиотек соединений для поиска ингибиторов, усовершенствована методология структурной фильтрации и отбора соединений в процессе компьютерного скрининга, проведено экспериментальное тестирование ряда идентифицированных ингибиторов. Проведено молекулярное моделирование влияния мутаций ATM протеинкиназы на способность фермента фосфорилировать целевые белки на основе биоинформатического анализа суперсемейства белков, определены консервативные и специфические позиции в структуре белка, получена трехмерная модель структуры функционального FATKIN домена ATM протеинкиназы, проведен анализ конформационных изменений.
7 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: 1. РЕФЕРАТ Задачей 2025 года было исследование участия и влияния биологически активных веществ на развитие патологических процессов на разных уровнях структурной организации живых систем. Исследовано влияние антидиабетических препаратов на нейровоспаление, изучена взаимосвязь энергетического метаболизма и врожденного иммунитета с анализом оксилипиновых профилей при воспалительных патологиях. За отчетный период проведены комплексные исследования с тремя низкомолекулярными веществами на моделях первичных астроцитов и острого нейровоспаления in vivo, включающие анализ 41 оксилипина методом ВЭЖХ-МС/МС, определение экспрессии провоспалительных маркеров и изучение внутриклеточных сигнальных путей. Установлено, что метформин потенцирует АТФ-индуцированный синтез противовоспалительных оксилипинов в астроцитах, в то время как семаглутид не влияет на воспалительный ответ при действии ЛПС, а 4-метилумбеллиферон демонстрирует выраженное противовоспалительное действие в острой модели нейровоспаления. Проведен анализ транскриптомных данных на предмет экспрессии белков, определяющих тиаминовый статус организма млекопитающих. При анализе биологических образцов человека планировали охарактеризовать механизмы возникновения тиамин-зависимых нарушений метаболизма, вызывающих гастроэнтерологические и неврологические патологии. Спектр тиамин-зависимых белков, проанализированный в работе с транскриптомными базами, предполагалось также сравнить с комплексными изменениями протеома и метаболома мозга в животной модели хронического введения антагониста тиамина – окситиамина. В результате проведенной по данному плану в 2025 году работы были решены все поставленные задачи и получены новые данные по механизмам действия тиамина и его антагониста, имеющие медицинское значение. По результатам исследований в 2025 году опубликовано 18 статей в рецензируемых отечественных и международных журналах, 1 статья в сборнике материалов, защищена 1 кандидатская диссертация, 1 дипломная работа. 2. ВВЕДЕНИЕ (Чистяков, Сергеева) Исследование путей регуляции функционирования живых систем разного уровня организации: белков, ферментов, полиферментных комплексов и рецепторных систем, а также поиск биологически активных веществ для модуляции их функциональных свойств представляет важную фундаментальную задачу современной биологии и медицины, имеющую непосредственное практическое значение, связанное с разработкой новых лекарственных препаратов и методов лечения. Такие исследования позволяют определить ранее неизвестные молекулярные мишени действия лекарств, установить новые детали механизма действия и регуляции известных мишеней, применить новые методы исследования и, в конечном итоге, провести поиск более эффективных и менее токсичных прототипов лекарственных препаратов. Важную роль в совершенствовании современных подходов в этой области играют методы молекулярного моделирования, биоинформатики и компьютерного скрининга. В последние годы большое внимание привлекают также исследования возможностей регуляции биологических процессов за счет комбинаторного воздействия на несколько ключевых регуляторных точек сложных биологических процессов, а также направленное изменение функциональных свойств белков и ферментов. Важным аспектом является изучение модуляции функционирования биологических систем начиная от отдельных биомакромолекул (белков, ферментов, нуклеиновых кислот) и вплоть до уровня мультибелковых комплексов, рецепторов, в том числе с учетом их локализации в различных органах и тканях. Принципиальным при выполнении данной темы является то, что вычислительные этапы являются вспомогательной стадией экспериментальных исследований: от изучения механизма действия отдельных ферментов, определения количественных характеристик действия модуляторов/ингибиторов, до исследования влияния регуляторов на уровне клеток и целого организма, применения разработанных подходов в медицине. Задачи исследования в рамках данной темы не ограничены поиском и характеристикой ингибиторов индивидуальных ферментов, целью исследования является также поиск путей модуляции иммунного ответа и соответствующих соединений, способных избирательно воздействовать на различные клетки иммунной системы, экспериментальное изучение регуляции функционирования нейтрофилов человека, применения разработанных подходов в лечении патологических состояний. Наряду с экспериментальными методами в рамках данной темы исследования активно используются методы компьютерного моделирования структуры и механизма действия отдельных ферментов, биоинформатического анализа для выяснения особенностей их действия в рамках суперсемейств, организации активных центров и регуляторных участков связывания, чтобы на основе понимания этих особенностей проводить поиск селективных модуляторов (ингибиторов) как прототипов лекарственных препаратов. Нейровоспаление является ключевым патогенетическим механизмом развития нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз. Астроциты, как основные участники врожденного иммунитета мозга, играют фундаментальную роль в формировании воспалительного ответа и способны выступать в роли как инициаторов, так и регуляторов воспалительного процесса через синтез цитокинов и специализированных липидных медиаторов. Развитие методов анализа производных полиненасыщенных жирных кислот - оксилипинов, позволяет комплексно охарактеризовать проявления клеточного воспалительного ответа. Оксилипины контролируют как инициацию, так и разрешение воспалительного процесса, и анализ их полного профиля дает более точное представление о статусе воспаления, нежели анализ отдельных соединений. Гипергликемия оказывает значительное влияние на функцию врожденной иммунной системы, включая воспалительные ответы глиальных клеток, Высокие концентрации глюкозы смещают ответ астроцитов в сторону повышенной экспрессии провоспалительных цитокинов и оксилипинов [Chistyakov и др., 2021]. Метформин, препарат первой линии для лечения диабета 2 типа, проявляет противовоспалительное действие путем активации AMPK-сигнализации и подавления NF-κB, Однако его механизмы воздействия на оксилипиновые профили требуют дальнейшего изучения. Семаглутид, аналог глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1), может обладать противовоспалительными свойствами через опосредованное подавление микроглиальной активации, однако его прямые эффекты на астроциты остаются недостаточно изученными. 4-MU (4-метилумбеллиферон) является ингибитором биосинтеза гиалуроновой кислоты. Ранее для него в экспериментах in vitro нами была показана способность модулировать профиль астроцитов, однако эффективность данного соединения в моделях in vivo не была охарактеризована [Chistyakov и др., 2020]. Целью данного этапа исследования явилось установление связи между энергетическим метаболизмом, регулируемым низкомолекулярными ингибиторами, синтезом оксилипинов и врожденными иммунными реакциями астроцитов и других клеток ЦНС при различных моделях нейровоспаления. Важным объектом при исследовании влияния биологически активных веществ на развитие патологических процессов в организме человека являются нейтрофилы. На данном этапе задачей нашей работы было изучение влияния тиол-дисульфидного обмена на функции нейтрофилов при бактериальных инфекциях. Координированное поведение нейтрофилов очень важно в борьбе с патогенами. Синтезируемый нейтрофилами лейкотриен В4 играет важнейшую роль в передаче сигнала между нейтрофилами, для привлечения дополнительного количества нейтрофилов к месту инфекции. Определение ключевых регуляторов физиологических функций нейтрофилов при бактериальной нагрузке имеет практическую значимость для поиска эффективных методов лечения инфекционных заболеваний. Особенности метаболизма разных типов раковых опухолей позволяют разрабатывать новые подходы для лечения онкологических заболеваний, основанные на поиске соединений, ингибирующих определенные этапы метаболических путей или влияющих на взаимодействие между белками- партнерами. Одной из перспективных мишеней является глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), которая не только регулирует эффективность гликолиза, но и вовлечена в другие процессы, в частности, во взаимодействие с мышечными белками, прежде всего с актином, обеспечивающими подвижность раковых клеток. Разные группы сложных, АТФ-зависимых шаперонинов вовлечены в развитие амилоидных нейродегенеративных заболеваний. Вопреки исходным представлениям об их благоприятном воздействии на патологическую трансформацию таких амилоидогенных белков как альфа-синклеин, прионный белок и др. оказалось, что в определенных условиях они могут стимулировать образование амилоидных структур. Необходимо дальнейшее изучение этих процессов с использованием разных типов шаперонинов, которое необходимо как для понимания механизмов развития нейродегенеративных заболеваний, так и для создания новых антиамилоидных соединений на основе шаперонинов. Исследование патологической трансформации и агрегации амилоидных белков требует постоянного развития и усовершенствования физико-химических методов их изучения, прежде всего дифференциальной сканирующей калориметрии и динамического рассеяния света, которое осуществляется проведением экспериментов на широком спектре объектов разной степени сложности. Задачей исследований на данном этапе является идентификация белков-партнеров GAPDH с целью разработки методов последующей таргетной терапии рака. Предполагается получить мутантные формы шаперонинов и исследовать их участие в развитии нейродегенеративных заболеваний. Поскольку окситиамин является продуктом окисления тиамина в организме человека и животных, накапливающимся при патологических состояниях – например, при тяжелой почечной недостаточности – системное понимание молекулярных механизмов действия окситиамина может быть использовано в медицине для облегчения вызываемых патологиями последствий. Знания об относительной экспрессии специфических белков метаболизма тиамина в пищеварительной системе востребованы медициной для терапии состояний тиаминового дефицита, требующих диагностики после оперативных вмешательств, затрагивающих пищеварительную систему. В поисках ответа на этот вопрос необходимо исследовать протеомные и метаболомные изменения мозга при хроническом воздействии окситиамина, изучить механизмы тиаминового дефицита и его роль в гастроэнтерологических нарушениях. В области изучения регуляции отдельных ферментов и поиска эффективных модуляторов их свойств задачей текущего года было исследование механизма действия ZMPSTE24 с использованием методов молекулярного моделирования, разработка математических моделей ферментативного ацильного переноса, катализируемого пенициллинацилазой, поиск новых ингибиторов нейраминидазы гриппа с улучшенной эффективностью против резистентных штаммов и изучение влияния промышленных ксенобиотиков глифосата и глюфосината на глутаматдегидрогеназу человека. Оценка действия промышленных ксенобиотиков глифосата и глюфосината на метаболизм млекопитающих имеет практическое значение для медицины и сельского хозяйства. Имеющиеся данные о хроническом действии глифосата на коров и рыб указывают на усиление катаболизма аминокислот, что способно снижать содержание общего белка. Потенциальные медицинские последствия для человека не менее значимы: избыточная активация глутаматдегидрогеназы в поджелудочной железе вызывает гиперинсулинемию и гипераммониемию, а нейромедиаторная функция глутамата и значение глутаматдегидрогеназы в мозге усиливает практическую значимость исследования действия ксенобиотиков на этот фермент. Ближайшей задачей в этом направлении мы поставили оценку влияния глифосата и глюфосината на глутаматдегидрогеназу человека. Идентификация новых классов ингибиторов нейраминидазы в обширных библиотеках соединений путем компьютерного скрининга является важной практической задачей медицинской химии. При этом для идентификации потенциальных ингибиторов необходимо в деталях понимать структурную организацию активного центра данного белка, а также обладать инструментами для подробного анализа межмолекулярных взаимодействий при моделировании. 3. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ Исследование влияния антидиабетических препаратов (метформин, семаглутид) на нейровоспаление, изучение взаимосвязи энергетического метаболизма и врожденного иммунитета с анализом оксилипиновых профилей при воспалительных патологиях. Исследования проводили на двух модельных системах: первичных астроцитах крысы и острой модели нейровоспаления in vivo — молодые самцы крыс Вистара подвергались двусторонней внутрижелудочковой инъекции либо ЛПС, либо 4-метилумбеллиферона, либо комбинации обоих веществ, либо носителя. Мозг исследовали через 6 часов после инъекции. Использовали следующие методы исследования: анализ экспрессии генов, анализ фосфорилирования белков, анализ липидных медиаторов (оксилипинов и полиненасыщенных жирных кислот, всего 41 соединение, включая производные арахидоновой кислоты: простагландины, тромбоксан, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты, производные эйкозапентаеновой кислоты 18-HEPE и др., производные докозагексаеновой кислоты, включая гидроксидокозагексаеновые кислоты, и иные липидные медиаторы), измерение концентрации гиалуроновой кислоты и последующий статистический анализ. При иучении влияния АТФ и метформина на профили оксилипинов астроцитов при разных концентрациях глюкозы обнаружено, что АТФ-стимуляция первичных астроцитов в условиях нормальной глюкозы (NG) за 15 минут и 4 часа вызывала достоверное увеличение синтеза производных циклооксигеназного пути (COX-пути), включая простагландины (PGD2, PGA2), тромбоксан B2 (TXB2), 12-HHT и 11-HETE. В то же время АТФ не влияло на экспрессию провоспалительных маркеров (TNFα, IL-6, IL-1β, iNOS), но активировало p38 и ERK MAPK с последующим смещением профиля оксилипинов в сторону повышения противовоспалительных соединений. В астроцитах, адаптированных к высокой глюкозе (HG), АТФ-индуцированный синтез оксилипинов был достоверно снижен. Эффекты АТФ на синтез PGD2, 12-HHT и TXB2 были менее выраженными в условиях HG по сравнению с NG. Кроме того, отмечалось значимое снижение CYP-производного 18-HEPE в условиях высокой глюкозы. Предварительная 24-часовая инкубация астроцитов с метформином (2,5 мМ) потенцировала АТФ-индуцированный синтез оксилипинов. При использовании вулканического графика для выявления синергических взаимодействий было установлено, что метформин значимо увеличивал АТФ-индуцированный синтез 11-HETE, PGD2, 12-HHT, 15-HETE, 13-HDoHE и 15-HETrE. Этот эффект был более выраженным в клетках, культивируемых в условиях нормальной глюкозы. Данные результаты свидетельствуют о том, что метформин может модулировать энергетический метаболизм астроцитов таким образом, чтобы переориентировать их ответ на АТФ в сторону повышенного синтеза противовоспалительных липидных медиаторов. По материалам исследования представлены тезисы на международной конференции “Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ”, МГУ имени М.В. Ломоносова, Россия, 20-22 февраля 2025. Опубликована статья “ATP Alters the Oxylipin Profiles in Astrocytes: Modulation by High Glucose and Metformin” в журнале BRAIN SCIENCES (Q2, IF = 2,8). Материалы были представлены и успешно защищены в научно-квалификационной работе аспиранта (В.О. Горбатенко). При изучении влияния семаглутида на ЛПС-стимулированный ответ астроцитов первичные астроциты крысы обрабатывались различными концентрациями семаглутида (0,9–18 мкМ) в течение 30 минут или 24 часов с последующей стимуляцией ЛПС (100 нг/мл, 4 часа). ЛПС вызывал выраженный провоспалительный ответ, характеризовавшийся значимым увеличением экспрессии TNFα, IL-6 и IL-1β, а также значительным повышением синтеза оксилипинов, преимущественно производных арахидоновой кислоты, образующихся по циклооксигеназному пути. Однако предварительная инкубация клеток с семаглутидом в тестировавшихся концентрациях не оказывала влияния ни на ЛПС-индуцированную экспрессию провоспалительных генов, ни на синтез оксилипинов. Отсутствие модулирующего действия семаглутида на воспалительный ответ астроцитов мы интерпретируем как отражение особенностей регуляции нейровоспаления на клетках эктодермального происхождения, поскольку эффекты семаглутида были ранее продемонстрированы на микроглии (мезодермального происхождения). По материалам исследования представлены тезисы на международной конференции “Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ”, МГУ имени М.В. Ломоносова, Россия, 20-22 февраля 2025 При изучении влияния 4-метилумбеллиферона в острой модели нейровоспаления in vivo внутрижелудочковая инъекция ЛПС вызывала выраженный острый воспалительный ответ в мозге крыс через 6 часов, характеризовавшийся значительным увеличением экспрессии провоспалительных генов: TNFα (в 14 раз), IL-6 (в 27 раз), IL-1β (в 63 раза), компонента комплемента C3 (в 12 раз) и iNOS (более чем в 300 раз) (Рис.1) и активацией синтеза оксилипинов, преимущественно производных арахидоновой кислоты по COX-пути. Рисунок 1. Схема in vivo эксперимента (А) и (Б) влияние 4-MU на LPS-стимулированное изменение экспрессии провоспалительных генов в гомогенате мозга крыс. Одновременное введение 4-MU с ЛПС приводило к достоверному снижению ЛПС-индуцированного высвобождения провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-1β, IL-6), а также к уменьшению увеличения производных циклооксигеназного пути (PGF2α, PGE2, 6-кето-PGF1α, TXB2, 12-HHT и 15-HETE). На уровне экспрессии генов, контролирующих синтез и деградацию гиалуроновой кислоты, ЛПС стимулировал экспрессию только HAS2. Добавление 4-MU к ЛПС значимо снижало ЛПС-стимулированную экспрессию HAS2, при этом индуцировалась экспрессия HYAL1, но не HYAL2. Это предполагает двойной механизм действия 4-MU: подавление синтеза гиалуроновой кислоты и активация ее деградации. По материалам исследования опубликована статья “Inhibitor of hyaluronic acid synthesis 4-methylumbelliferone (4-MU) as a potential anti-inflammatory substance in acute neuroinflammation model in vivo” в журнале Inflammopharmacology . 2025 Dec 3. doi: 10.1007/s10787-025-02063-8 (Q1, IF = 5,3). Важной задачей исследования в отчетном году был поиск белков-партнеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с целью последующей таргетной терапии рака, получение мутантных форм шаперонинов и исследование их участия в развитии нейродегенеративных заболеваний. Ранее нами было доказано, что в клетках меланомы присутствуют две формы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) – соматическая и спермоспецифичная, что обуславливает особенности метаболизма и метастазирования этого типа раковых клеток. Последующие исследования в нескольких лабораториях подтвердили данные наблюдения и показали важную роль спермоспецифичной GAPDH не только в жизнедеятельности клеточных линиях, но и в самих опухолях. Мы попытались найти новые белки-партнеры двух форм GAPDH и обнаружили среди них бета-актин. В отчетном году было установлено, что воздействие на GAPDH может влиять не только на энергетический метаболизм клетки, но и регулировать их подвижность. Было показано, что даже простейшие формы шаперонинов, а именно одно- и двух-кольцевые фаговые шаперонины OBP и EL оказывают влияние на амилоидную трансформацию альфа-синуклеина и овечьего прионного белка. При этом в присутствии АТФ оба шаперонина стимулируют образование амилоидных фибрилл, то есть оказывают такое же воздействие как исследованный ранее бактериальный шаперонин GroE. Амилоидные фибриллы альфа-синуклеина, сформированные в присутствие фаговых шаперонинов обладают более высокой цитотоксичностью при воздействии на клетки HEK293T и SH-SY5Y, чем спонтанно сформированне фибриллы. Более того, при одновременной экспрессии шаперонина OBP и альфа-синуклеина в клетках HEK293T наблюдается формирование амилоидных олигомерных структур, что свидетельствует о стимуляции амилодной трансформации в присутствии шаперонинов (Pozdyshev et al., Лейси). На основании этих результатов было начато получение мутантных форм фаговых шаперонинов, которые были бы способны предотвращать трансформацию амилоидогенных белков даже в присутствии АТФ с целью их последуюшего использования в качестве антиамилоидных реагентов. На первом этапе этих исследований было показано, что апикальный домен шаперонина OBP подавляет агрегацию альфа-синуклеина, а мутантная форма, лишенная апикальных доменов, действует на трансформацию альфа-синуклеина и прионного белка аналогично полноразмерному OBP, но с меньшей эффективностью (Лейси). На следующем этапе мы планируем получить мутантные формы шаперонина OBP с заменами в АТФ-азном, обладающие антиамилоидной активностью в присутствии АТФ. Было доказано, что модулировать амилоидную трансформацию альфа-синулеина можно также как синтетическими соединениями, такими как пиридилфениленовые дендримеры (Константинова и др.), так и другими амилоидогенными белками, а именно прионным белком (Kudryavtseva). Наиболее интересный эффект оказывает на трансформацию альфа-синуклеина N-концевой фрагмент прионного белка. Его добавление к альфа-синуклеину приводит к быстрому формированию небольших амилоидных структур без последующего образования крупных амилоидных фибрилл (Kudryavtseva). Эти наблюдения полезны как для понимания особенностей развития нейродегенеративных заболеваний при взаимодействии разных амилоидогенных белков друг с другом, так и для создания новых антиамилоидных агентов. Важным для развития исследований в этом направлении было усовершенствование и автоматизация двух основных физико-химических методов исследования объектов, используемых в данном проекте, а именно, дифференциальной сканирующей калориметрии и динамического рассеяния света. Широкий спектр исследованных этими методами соединений, включающий белки, полисахариды, синтетические полимеры и др. позволил увеличить достоверность полученных результатов и улучшить их интерпретацию (статьи 166-169). Важной задачей данного проекта является исследование роли нейтрофилов при бактериальных инфекциях в организме человека. На данном этапе целью нашей работы было изучение влияния тиол-дисульфидного обмена на функции нейтрофилов при бактериальных инфекциях. Исследовано влияние тиол-дисульфидного обмена на функции нейтрофилов при взаимодействии с бактериями Salmonella typhimurium. Основные результаты опубликованы в статье Front Immunol. 2025; 16:1606408. doi: 10.3389/fimmu.2025.1606408, и отмечена поддержка от МГУ по гостеме АААА-А19-119042590056-2. Нейтрофилы уничтожают бактерии, вызывая окислительный стресс с помощью НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы. Нетифоидные сальмонеллы, реагируя на окислительный стресс, продуцируют сероводород (H₂S). Бактерии используют H₂S для защиты от фагоцитов, в ответ на окислительный стресс, исходящий из фагоцитирующих бактерии лейкоцитов. H₂S увеличивает биосинтез глутатиона (GSH) и влияет на энергетический метаболизм. H₂S является эффективным поглотителем активных форм кислорода (АФК), а также обладает активностью, поддерживающей уровень глутатиона. В процессе воспаления окислительный статус тиолов клеточных белков динамически изменяется, с обратимым тиол-дисульфидным обменом между тиолами белков и внутриклеточным пулом GSH/дисульфида глутатиона (GSSG). Нами впервые показана регуляторная роль H₂S в синтезе лейкотриенов при взаимодействии нейтрофилов с бактериями Salmonella typhimurium. Активированные полиморфноядерные лейкоциты выделяют активные формы кислорода при уничтожении бактерий. Обнаружено, что дисульфидный стресс, возникающий в присутствии H₂S и активных форм кислорода снижает синтез лейкотриенов, т.е. при работающем механизме уничтожения бактерий синтез не растёт. Однако дисульфидный стресс в отсутствие АФК увеличивает синтез лейкотриенов. Наше исследование показало, что нарушение баланса тиол-дисульфид играет решающую роль в синтезе LTB4, обеспечивая роение нейтрофилов в микробных кластерах. Рис.2. Влияние активных форм кислорода (ROS) и тиол-дисульфидного окислительного стресса на активацию 5-липоксигеназы (5-LO) в нейтрофилах Если нейтрофилы сохраняют антимикробный потенциал в виде ROS, то повышения синтеза лейкотриена В4 не происходит. Проникновение в клетку H2S, подавляющего микробицидную активность нейтрофилов, провоцирует у нейтрофилов индукцию синтеза лейкотриенов, что привлечет больше нейтрофилов к инвазии микробов. При снижении продукции ROS под действием H₂S происходит увеличение синтеза лейкотриенов. И не продуцирующий ROS тиол-дисульфидный стресс под действием диамида также повышал синтез лейкотриеноа В4, что обеспечивает привлечение дополнительного количества нейтрофилов при бактериальных инфекциях. Определение регуляторов физиологических функций нейтрофилов при бактериальной нагрузке необходимо для поиска эффективных методов лечения инфекционных заболеваний. В 2025 году проанализированы транскриптомные базы данных на предмет экспрессии белков, определяющих тиаминовый статус организма млекопитающих. При анализе биологических образцов человека охарактеризованы механизмы возникновения тиамин-зависимых нарушений метаболизма, вызывающих гастроэнтерологические и неврологические патологии. Спектр тиамин-зависимых белков, проанализированный в работе с транскриптомными базами, учитывали при анализе комплексных изменений протеома и метаболома мозга в животной модели хронического введения антагониста тиамина – окситиамина. В результате проведенной в 2025 году работы получены новые данные по механизмам действия тиамина и его антагониста, имеющие медицинское значение. При дефиците тиамина наблюдается многообразие пишеварительных дисфункций, включая нарушения в подвижности желудка и кишечника, функции поджелудочной железы, кислотности желудка, целостности кишечного барьера и воспалительных реакциях. С использованием баз данных нами определены достоверные изменения уровня транскриптов белков, для которых показано или предполагается участие в метаболизме тиамина и производных, после бариатрической хирургии в долгосрочной периоде (Рис.3). На основе проведенного анализа сделан вывод о долгосрочной компенсаторной реакции белков тиаминового метаболизма на уменьшение объема желудка для снижения веса. Полученные результаты проясняют механизмы возникновения тиаминового дефицита при таких операциях и показывают, что снижение доступности пищи для снижения веса чревато нарушениями доступности витаминов и микроэлементов, что требует их дополнительного введения. В модели хронического введения крысам каталитически неактивного аналога тиамина – окситиамина – показаны значительные изменения протеома мозга. В Таблице 1 полученные данные сгруппированы по белкам категорий, наиболее близко связанных с метаболическим действием тиамина. Table 1. Selected groups of the rat brain proteome related to ThDP-dependent metabolic pathways, thiamine metabolism and neurotransmission, after chronic exposure to OT. F - Maximal fold change, p – statistical significance of a change, “highest mean” refers to the group where the mean abundance is higher than in the other group. Statistically significant changes with p0.05 are highlighted in red. Trends with p0.1 are highlighted in blue. Protein group Protein identificator Protein name F p Highest mean Dehydrogenases of 2-oxo acids P26284|ODPA_RAT Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial 1,3 0,02 OT Q64536|PDK2_RAT [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 2, mitochondrial 1,2 0,13 OT Q06437|ODPAT_RAT Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, testis-specific form, mitochondrial 2,0 0,32 control P49432|ODPB_RAT Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial 1,1 0,69 control P08461|ODP2_RAT Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial 1,1 0,70 control Q5XI78|ODO1_RAT 2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial 1,6 0,13 OT D3ZQD3|OGDHL_RAT 2-oxoglutarate dehydrogenase-like, mitochondrial 2,4 0,60 control Q01205|ODO2_RAT Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial 1,4 0,02 OT P11960|ODBA_RAT 2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit alpha, mitochondrial 1,8 0,05 OT P35738|ODBB_RAT 2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit beta, mitochondrial 1,0 0,71 control Q6P6R2|DLDH_RAT Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial 1,0 0,43 control Transketolase & sugar metabolism P50137|TKT_RAT Transketolase 1,3 0,10 OT P27881|HXK2_RAT Hexokinase-2 1,4 0,99 OT P04642|LDHA_RAT L-lactate dehydrogenase A chain 1,2 0,95 control P42123|LDHB_RAT L-lactate dehydrogenase B chain 1,2 0,43 control P18266|GSK3B_RAT Glycogen synthase kinase-3 beta 1,7 0,01 OT P30835|PFKAL_RAT ATP-dependent 6-phosphofructokinase, liver type 1,4 0,01 OT P05065|ALDOA_RAT Fructose-bisphosphate aldolase A 1,7 0,01 OT P07323|ENOG_RAT Gamma-enolase 1,5 0,01 OT Q9ESV6|G3PT_RAT Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific 1,1 0,75 OT Transaminases P54690|BCAT1_RAT Branched-chain-amino-acid aminotransferase 1,7 0,003 OT P00507|AATM_RAT Aspartate aminotransferase, mitochondrial 1,8 0,004 OT P50554|GABT_RAT 4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial 1,5 0,01 OT P25409|ALAT1_RAT Alanine aminotransferase 1 1,4 0,05 OT O35854|BCAT2_RAT Branched-chain-amino-acid aminotransferase, mitochondrial 2,0 0,14 OT Q58FK9|KAT3_RAT Kynurenine--oxoglutarate transaminase 3 1,2 0,10 OT Q08415|KAT1_RAT Kynurenine--oxoglutarate transaminase 1 1,0 0,74 OT Glutamate metabolism P10860|DHE3_RAT Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial 1,4 0,03 OT Q505J6|GHC2_RAT Mitochondrial glutamate carrier 2 1,2 0,17 control Q05683|DCE2_RAT Glutamate decarboxylase 2 1,0 0,51 control P18088|DCE1_RAT Glutamate decarboxylase 1 1,0 0,86 control P09606|GLNA_RAT Glutamine synthetase 1,8 0,005 OT P28492|GLSL_RAT Glutaminase liver isoform, mitochondrial 1,3 0,09 OT P13264|GLSK_RAT Glutaminase kidney isoform, mitochondrial 1,2 0,15 OT Other enzymes affiliated with ThDP-dependent dehydrogenases Q561S0|NDUAA_RAT NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 10, mitochondrial 1,9 0,002 OT Q641Y2|NDUS2_RAT NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 2, mitochondrial 1,7 0,01 OT Q99NA5|IDH3A_RAT Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial 1,6 0,01 OT Q68FX0|IDH3B_RAT Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial 1,7 0,01 OT P41565|IDHG1_RAT Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit gamma 1, 1,4 0,01 OT P52873|PYC_RAT Pyruvate carboxylase, mitochondrial 1,0 0,53 control Q6AY30|SCPDL_RAT Saccharopine dehydrogenase-like oxidoreductase 1,6 0,01 OT Q64057|AL7A1_RAT Alpha-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase 1,2 0,07 OT Selected transporters of metabolites Q07647|GTR3_RAT Facilitated glucose transporter member 3 1.1 0.19 OT P11167|GTR1_RAT Facilitated glucose transporter member 1 1.2 0.41 OT P0C546|S2542_RAT Mitochondrial coenzyme A transporter 1,2 0,61 control Q52KK3|S2551_RAT Mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide transporter SLC25A51 1,6 0,52 control P32089|TXTP_RAT Tricarboxylate transport protein, mitochondrial 1,5 0,50 OT P97700|M2OM_RAT Mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier 1,0 0,93 OT Thiamine metabolism O35795|ENTP2_RAT Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 2,1 0,06 control Q8VD52|PLPP_RAT Chronophin 1,2 0,96 OT D3ZZX1|I5P1_RAT Inositol polyphosphate-5-phosphatase A 1 1,4 0,30 OT Q8CGV7|THTPA_RAT Thiamine triphosphatase 1,1 0,43 control Q05982|NDKA_RAT Nucleoside diphosphate kinase A 1,0 0,46 control P19804|NDKB_RAT Nucleoside diphosphate kinase B 1,6 0,86 OT P39069|KAD1_RAT Adenylate kinase isoenzyme 1 1,1 0,48 control P29410|KAD2_RAT Adenylate kinase 2, mitochondrial 1,1 0,61 control Q9WUS0|KAD4_RAT Adenylate kinase 4, mitochondrial 1,5 0,09 control O35331|PDXK_RAT Pyridoxal kinase 1,4 0,06 control Acylation Q4QQW4|HDAC1_RAT Histone deacetylase 1 2,6 0,80 OT Q5RJQ4|SIR2_RAT NAD+-dependent protein deacetylase sirtuin-2 1,1 0,81 OT Q68FX9|SIR5_RAT NAD+-dependent protein deacylase sirtuin-5, mitochondrial 1,2 0,76 control Choline metabolism B0BND0|ENPP6_RAT Glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase 2,0 0,002 OT Glutamat-ergic system P19490|GRIA1_RAT Glutamate receptor 1 1,3 0,63 OT P19491|GRIA2_RAT Glutamate receptor 2 1,4 0,05 OT P19493|GRIA4_RAT Glutamate receptor 4 1,1 0,60 control P24942|EAA1_RAT Excitatory amino acid transporter 1 1,0 0,95 OT P31596|EAA2_RAT Excitatory amino acid transporter 2 1,0 0,91 control Q62634|VGLU1_RAT Vesicular glutamate transporter 1 1,8 0,21 OT GABA-ergic system O88871|GABR2_RAT Gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 2 1,4 0,05 OT P23978|SC6A1_RAT Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 1 1,1 0,13 OT P31647|S6A11_RAT Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3 1,4 0,03 OT P62813|GBRA1_RAT Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1 1,3 0,30 control P63138|GBRB2_RAT Gamma-aminobutyric acid receptor subunit beta-2 1,0 0,36 control Potassium Channels P10499|KCNA1_RAT Potassium voltage-gated channel subfamily A member 1 1,3 0,25 control P63142|KCNA2_RAT Potassium voltage-gated channel subfamily A member 2 1,3 0,08 control P62483|KCAB2_RAT Voltage-gated potassium channel subunit beta-2 1,2 0,10 OT Q63511|KCNJ9_RAT G protein-activated inward rectifier potassium channel 3 1,4 0,17 OT Q99MG9|KCIP4_RAT Kv channel-interacting protein 4 1,4 0,96 control Q62976| KCMA1_RAT Calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 1,2 0,37 OT Calcium-dependent channels and transporters B0LPN4|RYR2_RAT Ryanodine receptor 2 1,1 0,36 OT D4A055|CACB4_RAT Voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-4 1,8 0,05 control P54290|CA2D1_RAT Voltage-dependent calcium channel subunit alpha-2/delta-1 1,4 0,39 OT Q8R4C1|AT2C2_RAT Calcium-transporting ATPase type 2C 1,5 0,04 control Q8VHW5|CCG8_RAT Voltage-dependent calcium channel gamma-8 subunit 2,0 0,03 OT Na⁺/K⁺-ATPase subunits P06685|AT1A1_RAT Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 1,1 0,73 OT P06686|AT1A2_RAT Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-2 1,5 0,11 OT P06687|AT1A3_RAT Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-3 1,5 0,004 OT Q64541|AT1A4_RAT Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-4 1,1 0,78 control P07340|AT1B1_RAT Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1 1,7 0,01 OT P13638|AT1B2_RAT Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-2 2,3 0,01 OT Q63377|AT1B3_RAT Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3 1,5 0,07 OT Synaptic proteins P07825|SYPH_RAT Synaptophysin 2,0 0,002 OT P21707|SYT1_RAT Synaptotagmin-1 1,1 0,64 OT P31016|DLG4_RAT Disks large homolog 4 1,2 0,23 OT P32851|STX1A_RAT Syntaxin-1A 1,3 0,05 control P37377|SYUA_RAT Alpha-synuclein 1,3 0,15 control P60881|SNP25_RAT Synaptosomal-associated protein 25 1,1 0,23 control P63045|VAMP2_RAT Vesicle-associated membrane protein 2 1,0 0,29 OT Q80WE1|FMR1_RAT Synaptic functional regulator FMR1 1,9 0,11 OT Результаты измерения активности и насыщении ТДФ цитоплазматической транскетолазы и митохондриальной 2-оксоглутаратдегидрогеназы согласуются с протеомными данными и с отсутствием понижения уровня коферментной формы тиамина – ТДФ –после введения окситиамина. Активность цитоплазматической транскетолазы в мозге крыс снижается в результате хронического введения окситиамина, однако этот эффект исчезает при добавлении в среду определения активности ТДФ. Отсюда можно предположить, что снижение активности эндогенно насыщенной ТДФ транскетолазы обусловлено частичным заполнением активных центров антагонистом ТДФ - окситиаминдифосфатом. Для митохондриального же комплекса 2-оксоглутаратдегидрогеназы после введения окситиамина насыщение коферментом ТДФ возрастает, однако общая активность фермента не меняется. Поскольку протеомные данные показывают рост содержания 2-оксоглутаратдегидрогеназы в мозге крыс после введения окситиамина, повышенное содержание фермента может способствовать обнаруженному росту его насыщения даже при том же уровне ТДФ в мозге. Таким образом, результаты измерений активностей тиамин-зависимых ферментов свидетельствуют о компенсаторном значении идентифицированных изменений протеома мозга. Повышенная экспрессия этих ферментов может уменьшать наблюдаемое снижение активности транскетолазы вследствие связывания дифосфорилированного окситиамина и способствовать наблюдаемому росту насыщения коферментом 2-оксоглутаратдегидрогеназы. Компенсаторный рост представленности ТДФ-зависимых ферментов сопровождается ростом и связанных с ними физически и/или метаболически белков. В частности, растет представленность ферментов митохондриального цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), поток субстрата через который лимитирует ТДФ-зависимая 2-оксоглутаратдегидрогеназа. С другой стороны, идентифицированные ферменты метаболизма тиамина показывают тенденцию к пониженной представленности или отсутствие изменений. Для системной характеристики метаболических изменений при хроническом введении окситиамина проведен сравнительный анализ профилей свободных аминокислот мозга контрольных и подвергшихся действию окситиамина животных. Сравнение показывает изменение уровня аминокислот – участников трансаминирования пирувата (аланин) и 2-оксоглутарата (аспартат), однако уровни основного возбуждающего нейротрансмиттера – глутамата – и образующегося из него основного тормозящего нейротрансмиттера – гамма-аминомасляной кислоты – поддерживаются постоянными (Рис.3). Рис.3. Сравнение уровней содержащих аминогруппу соединений в коре мозга контрольных (полые символы) и подвергшихся действию окситиамина (заполненные символы) крыс. Очевидно, такое постоянство достигается описанными выше компенсаторными изменениями протеома. Помимо действия окситиамина на системы метаболизма, хроническое введение окситиамина приводит и к достоверным изменениям в системах нейротрансмиссии. Эти данные хорошо согласуются с наличием как коферментного, так и некоферментного действия тиамина. При этом в случае коферментного действия каталитически неактивный окситиамин выступает как антагонист тиамина, тогда как в механизмах некоферментного действия структурно сходный с тиамином окситиамин может быть агонистом. В области изучения регуляции отдельных ферментов и поиска эффективных модуляторов их свойств задачей текущего года была оценка действия промышленных ксенобиотиков глифосата и глюфосината на на глутаматдегидрогеназу человека, исследование механизма действия ZMPSTE24 с использованием методов молекулярного моделирования, разработка математических моделей ацильного переноса, катализируемого пенициллинацилазой, и поиск новых ингибиторов нейраминидазы гриппа с улучшенной эффективностью против резистентных штаммов. Ген глутаматдегидрогеназы человека GLUD2 был клонирован в вектор, содержащий N-концевой гексагистидиновый тэг. Оказалось, что при экспрессии белок зачастую формирует «тельца включения», и рефолдинг белка из них крайне затруднителен, поэтому в поисках системы экспрессии глутаматдегидрогеназы человека ГДГ2 было протестировано 6 экспрессионных штаммов E.coli: Shuffle express, BL21(DE3), BL21(DE3)Codon Plus RIL, Rosetta (DE3), Rosetta 2 (DE3), BL21(DE3)pUBS520. Лишь два из них позволяли экспрессию ГДГ2 в растворенной форме: BL21(DE3) и Rosetta 2 (DE3). Эти штаммы обеспечивали одинаковый уровень экспрессии ГДГ2, поэтому для дальнейшей работы был выбран штамм Rosetta 2 (DE3). Проверка условий экспрессии показала, что в данном штамме белок не требователен к температуре экспрессии в диапазоне 14-37°C, не образует «тельца включения», но уровень экспрессии низок и практически не увеличивается при увеличении концентрации индуктора IPTG. Несмотря на описанные сложности, эффективность системы экспрессии оказалась достаточной для получения, последующей очистки, подбора условий хранения и измерения активности рекомбинантной ГДГ2 человека, а также первичной характеристики действия регуляторов, в том числе глифосата и глюфосината. Удельная активность рекомбинантной ГДГ2 составила 2,4 E/мг, что соответствовало диапазону 1,5-4 E/мг из литературных источников. Проведенная оценка действия геруляторов глифосата и глюфосината на ГДГ2 человека выявила активацию глифосатом до 80% от исходной активности при концентрации глифосата до 2,5 мМ. Глюфосинат не оказывал эффекта на активность ГДГ2 в аналогичных условиях (Рис.3). Столь сильная активация ГДГ2 характерна для известных аллостерических активаторов – АДФ и лейцина. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что глифосат действует аналогично лейцину, связываясь с его регуляторным сайтом. Рис.3 Влияние глифосата и глюфосината на активность ГДГ2 человека. Цинк-зависимая мембранная металлопротеаза ZMPSTE24 участвует в созревании ламина А, мутации фермента приводят к ряду заболеваний (ламинопатий), поэтому изучение механизма действия и методов регуляции активности представляет интерес для медицины. Координация иона металла в активном центре Zn2+-зависимых ферментов является важным элементом каталитического механизма. В случае ZMPSTE24 отсутствует структура с высоким разрешением и изучение координационной сферы иона цинка проводили с помощью моделирования. Мы получили модельную структуру комплекса фермента с аналогом природного субстрата — пятнадцатичленным C-концевым участком преламина А и с помощью QM/MM метадинамики исследовали координационное число иона цинка в присутствии и в отсутствие субстрата. Моделирование показало, что в отсутствие субстрата, помимо остатков His335, His339 и Glu415, лигандами иона цинка могут быть одна или две молекулы воды, переход между состояниями практически не разделен энергетическим барьером. При наличии субстрата атом кислорода гидроксильной группы, разрывающей пептидную связь, становится лигандом иона цинка, к нему может быть добавлена молекула воды. Переключение между этими состояниями происходит через низкий энергетический барьер. Полученные данные позволили понять структурную организацию активного центра ZMPSTE24 и получить стартовую структуру для моделирования каталитических стадий ферментативной реакции. При разработке математических моделей ферментативного ацильного переноса в водной среде рассмотрены кинетические схемы, предполагающие связывание внешнего нуклеофила с промежуточным ацилферментным интермедиатом и поведение системы при разных скорость лимитирующих стадиях этого процесса: превращения комплекса ацилфермент-внешний нуклеофил в продукт ацильного переноса, гидролиза ацилфермента как в свободном виде, так и в комплексе ацилфермент-внешний нуклеофил, а также в комплексе ацилфермент-уходящая группа ацильного донора. Разработаны рекомендации по проведению кинетических экспериментов, позволяющих дискриминировать разные кинетические схемы. Для дискриминации кинетических схем в реакциях, катализируемых пенициллинацилазой, в будущем году будут проведены экспериментальные исследования. Выбор адекватной кинетической схемы для ферментативного ацильного переноса имеет принципиальное значение для оптимизации процессов ферментативного синтеза физиологически активных соединений и выборе ацильных доноров. Идентификация новых классов ингибиторов нейраминидазы в обширных библиотеках соединений путем компьютерного скрининга является важной практической задачей медицинской химии. При этом для идентификации потенциальных ингибиторов необходимо в деталях понимать структурную организацию активного центра данного белка, а также обладать инструментами для подробного анализа межмолекулярных взаимодействий при моделировании. Проведен компьютерный поиск новых бифункциональных ингибиторов нейраминидазы вируса гриппа, содержащих структурные фрагменты, способные взаимодействовать как с активным центом фермента, так и с близлежащей полостью 430. Соединения данного типа, разрабатываемые в нашей лаборатории, образуют специфические взаимодействия с основным, наиболее важным участком связывания сиаловой кислоты, а также дополнительные гидрофобные контакты на участке, мало подверженном мутациям (Рис.4). Такие ингибиторы нейраминидазы, предположительно, помогут преодолеть лекарственную устойчивость, которая вырабатывается у вируса гриппа при использовании стандартных препаратов типа озельтамивир. Прежде всего, проанализирован актуальный набор кристаллических структур нейраминидазы, представленный в Protein Data Bank. Произведено сравнение строения активных центров у различных подтипов нейраминидазы, оценено возможное влияние мутаций у резистентных штаммов на интерфейс взаимодействия с ингибиторами. С помощью функционала разрабатываемой нами программы структурной фильтрации vsFilt (https://biokinet.belozersky.msu.ru/vsfilt) осуществлено картирование активного центра нейраминидазы и определение аминокислотных остатков, способных вступать во взаимодействие с низкомолекулярными лигандами-ингибиторами. Программа vsFilt позволяет пользователю задать искомые межмолекулярные взаимодействия для отбора наиболее перспективных ингибиторов при анализе докированных позиций, полученных в результате компьютерного скрининга. Например, в случае нейраминидазы, особое значение имеют водородные связи между линкером бифункционального ингибитора и так называемой аргининовой триадой (Arg118-Arg292-Arg371). Путем тестирования различных библиотек низкомолекулярных соединений мы пришли к выводу, что ключевое значение при отборе ингибиторов по критерию образования водородных связей с мишенью имеют не только дистанционные характеристики комплексов (расстояние между атомом-донором и атомом-акцептором водородной связи), но и угловые характеристики. Водородная связь весьма чувствительна к направлению. В связи с этим, в программе vsFilt был реализован более сложный алгоритм для детектирования водородных связей. Теперь (помимо вычисления расстояний) рассчитывается (a) ориентация донорной группы: угол «донор-водород…акцептор» (например O-H…H) и (б) ориентация акцепторной группы (например H-O…H); примеры приведены на Рис.5. Новый функционал vsFilt будет использован в следующем году для идентификации новых ингибиторов нейраминидазы вируса гриппа, а также ингибиторов других мишеней. Рис.4 Схематическое изображение бифункционального ингибитора нейраминидазы. Соединенные линкером фрагменты 1 и 2 занимают различные участки связывания на поверхности белка. Рис.5 Угловые характеристики водородной связи, рассматриваемые алгоритмом vsFilt. (а) Водородная связь донорной группы. (б) Водородная связь акцепторной группы. Разработка эффективных и доступных методов хирального анализа аминокислот является важной научной и практической задачей. Одной из наиболее распространенных и удобных методик является хроматографическое определение отдельных энантиомеров аминокислот с предварительным превращением энантиомеров в диастереомеры, которые затем можно разделить на обычных ахиральных колонках. Нами показано, что при добавлении ион-парных реагентов в состав элюента и варьировании их структуры можно регулировать эффективность хирального анализа аминокислот, основанного на хроматографическом определении и разделении диастереомерных изоиндолов, полученных при предколоночной модификации аминокислот под действием о-фталевого альдегида в присутствии N-ацетил-L-цистеина. Использование ион-парных реагентов позволяет добиться лучшего разделения пиков диастереомерных изоиндолов, при этом время анализа можно существенно сократить за счет увеличения ионной силы. Таким образом, добавление ион-парных реагентов и оптимизация состава подвижной фазы является важным подходом в инженерии хирального анализа аминокислот наряду с синтезом новых хиральных SH-соединений и подбором стационарных фаз. 4) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные в 2025 году исследования позволили установить взаимосвязь между энергетическим метаболизмом, регулируемым антидиабетическими препаратами, и врожденными иммунными ответами астроцитов, в первую очередь с фокусом на синтез окисленных производных ПНЖК - оксилипинов. Важным наблюдением явилось обнаружение того, что метформин потенцирует АТФ-индуцированный синтез противовоспалительных оксилипинов, что указывает на глубокие связи между метаболизмом энергии и воспалением. Отсутствие эффекта семаглутида на воспалительный ответ астроцитов указывает на необходимость дифференцированного подхода к применению ГПП-1-рецепторных агонистов в контексте нейровоспаления. Выявленное мощное противовоспалительное действие 4-метилумбеллиферона, ингибитора синтеза гиалуроновой кислоты, как в культуре клеток, так и в острой модели нейровоспаления in vivo, открывает перспективы для разработки новых подходов к фармакологической коррекции нейровоспаления при различных патологиях мозга. Полученные результаты имеют значение для понимания молекулярных механизмов нейровоспаления и могут служить основой для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на модуляцию функции астроцитов и липидного медиаторного профиля при нейродегенеративных заболеваниях и острых поражениях центральной нервной системы. 4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Опубликованные статьи Inhibitor of hyaluronic acid synthesis 4-methylumbelliferone (4-MU) as a potential anti-inflammatory substance in acute neuroinflammation model in vivo” // Inflammopharmacology . 2025 Dec 3. doi: 10.1007/s10787-025-02063-8. - есть ссылка на госзадание без номера ATP Alters the Oxylipin Profiles in Astrocytes: Modulation by High Glucose and Metformin” // Brain Sci. 2025, 15(3), 293; doi:10.3390/brainsci15030293 Pozdyshev DV, Leisi EV, Muronetz VI, Golyshev SA, Kurochkina LP. Cytotoxicity of α-synuclein amyloid fibrils generated with phage chaperonin OBP. Biochem Biophys Res Commun. 2025 Jan;742:151127. doi: 10.1016/j.bbrc.2024.151127. Epub 2024 Dec 6. PMID: 39644608. Константинова А.В., Поздышев Д.В., Сорокина С.А., Шифрина З.Б., Муронец В.И., Стройлова Ю.Ю. Образование композитных структур пиридилфениленовыми дендримерами с альфа-синуклеином. ИНЭОС OPEN, 2025. Kudryavtseva S, Stroylova Y, Smolskaya S, Leisi E, Barinova K, Muronetz V. Exploring the impact of prion protein N- and C-terminal fragments on the pathological transformation of alpha-synuclein. Biochimie. 2025 Oct 8;240:100-111. doi: 10.1016/j.biochi.2025.10.004. Interaction between partially betainated chitosan and albumin in alkalescent media Безродных Е.А., Вышиванная О.В., Тищенко Н.А., Тихонов В.Е., Антонов Ю.А., Орлов В.Н., Благодатских И.В. в журнале ИНЭОС OPEN, издательство Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова Российской академии наук (Москва) DOI Effect of overall charge of oligochitosan on structure and thermal stability of ovalbumin and thermodynamic properties ovalbumin/ oligochitosan systemsю Zhuravleva Irina L., Bezrodnykh Evgeniya A., Orlov Viktor N., Berezin Boris B., Tikhonov Vladimir E., Antonov Yurij A. в журнале Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, издательство Akademiai Kiado (Hungary) DOI Complexation of alkaline soluble Chitosan with maleic acid copolymer Tishchenko Nikita A., Vyshivannaya Oxana V., Samoilova Nadezhda A., Tikhonov Vladimir E., Bezrodnykh Evgeniya A., Orlov Victor N., Blagodatskikh Inesa V. в журнале Journal of Polymer Research, издательство Springer Nature (Switzerland), том 32, № 7 DOI Nanosized theranostic agent based on PEGylated branched polylactide modified with gadolinium (III) oxide for doxorubicin cancer treatment and MRI diagnostics. Loginova Tatiana P., Baranov Oleg V., Pozdniakova Natalia V., Shtykova Eleonora V., Ezernitskaya Mariam G., Orlov Victor N., Shchetinin Igor V., Kovalev Alexey I., Korlyukov Alexander A., Talanova Valeria N., Markova Gali D., Nikolaev Stanislav A., Ivanovskaya Ekaterina V., Sveshnikova Anastasia N., Mezhuev Yaroslav O. в журнале Journal of Nanoparticle Research, издательство Springer Nature (Switzerland), том 27, с. 1-21 DOI Golenkina EA, Navarnova SV, Viryasova GM, Galkina SI, Gaponova TV, Romanova YM, Sud'ina GF. Sulfur compounds navigate redox processes, leukotriene synthesis, and ω-hydroxylation of leukotriene B4 in neutrophil interaction with the bacteria Salmonella typhimurium: the way to manipulate neutrophil swarming. Front Immunol. 2025; 16:1606408. doi: 10.3389/fimmu.2025.1606408. Sud'ina GF. Neutrophils, Fast and Strong 2.0: Heterogeneity of Neutrophil Parameters in Health and in Disease. Biomedicines. 2025;13(2):436. doi: 10.3390/biomedicines13020436. Silva Dos Santos H., Veselovsky A., Nilov D. Editorial: Approaches to improve the performance of virtual screening: scoring functions, structural filtration, prediction of physicochemical properties/pharmacological activity. (2025) Front. Pharmacol., 16, 1658699. Диссертации Лейси Е.В. «Влияние фаговых шаперонинов на патологическую трансформацию амилоидных белков». Кандидатская диссертация по специальности 1.1.10 - Биомеханика и биоинженерия (биол. науки). 2025 Доклады на конференциях Влияние семаглутида на лпс-стимулированный ответ астроцитов (Стендовый) Авторы: Чистяков В.В., Горбатенко В.О., Горяинов С.В., Чистяков Д.В., Сергеева М.Г. Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ, МГУ имени М.В. Ломоносова, Россия, 20-22 февраля 2025 АТФ как провоспалительный стимул астроцитов (Стендовый) Авторы: Горбатенко В.О., Дрождев А.И., Горяинов С.В., Чистяков Д.В., Сергеева М.Г. Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ, МГУ имени М.В. Ломоносова, Россия, 20-22 февраля 2025 Роль рецептора для конечных продуктов гликирования (RAGE) в активации нейтрофилов. Иммуномодулирующий потенциал анти-RAGE аптамеров. (Стендовый) Авторы: Наварнова С.В., Вирясова Г.М., Голенкина Е.А. Конференция "Физико-химическая биология в год 270-летия МГУ", Москва, МГУ, Россия, 20-22 февраля 2025.
8 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: -
9 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: -
10 1 января 2028 г.-31 декабря 2028 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: -
11 1 января 2029 г.-31 декабря 2029 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: -

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".