Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов.НИР

Design and obtaining of antibacterial substances on the basis of the structural analysis of the ribosome. DNA aptamers as a promising class of therapeutic agents.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы
Результаты этапа: В рамках проекта по поиску антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы проводилась работа, направленная на дизайн, синтез и изучение взаимодействия с рибосомой новых инструментов для исследования механизма регуляции трансляции, полученных на основе антибиотиков, специфически взаимодействующих с рибосомой в области А-сайта ее пептидилтрансферазного центра. Такие соединения представляют несомненный интерес как зонды для изучения регуляции функционирования рибосомы, а также как вещества, на базе которых могут быть созданы новые антибиотики. На основе имеющихся в литературе данных об атомной структуре комплексов этих антибиотиков с большой субъединицей рибосомы осуществляется работа по созданию соединений, которые способны, с одной стороны, образовывать прочные комплексы с рибосомой за счет собственно антибиотика или его фрагмента, выполняющих роль «якоря», а с другой, взаимодействовать с функционально важными сайтами рибосомного туннеля c помощью связанного с “якорем” заместителя (“щупа”). В качестве антибиотиков, играющих роль «якоря», в этих молекулах используются хлорамфеникол и цефалотаксин, связывание которых с А-сайтом ПТЦ рибосомы хорошо доказано. Заместители (“щупы”) в гибридных молекулах представлены аминокислотными, пептидными и другими радикалами, в том числе, гидрофобными, несущими положительный заряд, такими как, различные аргинин-содержащие пептиды, включая «стоп-пептиды», а также карнитины, бетаины и др. Выбор такого рода заместителей основывается как на литературных данных последних лет, так и на наших собственных результатах, касающихся взаимодействия элементов рибосомного туннеля с боковыми цепями растущей полипептидной цепи. В 2014 г. методом молекулярной динамики осуществлено компьютерное моделирование ряда производных тилозина и эритромицина в комплексах с прокариотическими рибосомами. Синтетическим путем получена серия аминокислотных и пептидных производных хлорамфеникола, структура которых выбрана на основе компьютерного скрининга. Для полученных соединений определены константы связывания с рибосомой E.coli методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченных антибиотиков, а также изучена ингибирующая активность в системе трансляции люциферазы светлячков, выявлены активные производные хлорамфеникола. Для понимания общих принципов устройства области посадки рибосом на мРНК мы клонировали в репортерную конструкцию перед геном флюоресцентного белка CER библиотеку рандомизированных последовательностей. В первой библиотеке была рандомизирована область к 5’ концу от последовательности Шайн-Дальгарно: GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGGAGCAACUAUG Три варианта плазмидных библиотек содержали рандомизированные области между последовательностью Шайн-Дальгарно и инициаторным кодоном: CACACAACACCGGAGCNNNNCAUAUG, CACACAACACCGGAGCNNNNNNNCAUAUG и CACACAACACCGGAGCNNNNNNNAUG. И, наконец, одна из библиотек содержала рандомизированную область 20 нуклеотидов к 5’ от инициаторного AUG кодона. Плазмидные библиотеки были трансформированы в клетки E. coli до количества 1 000 000 колоний. После выращивания, клетки были отсортированы на сортере клеток на 7 фракций, отличающихся соотношением флюоресценции CER/RFP. При этом ген RFP использовался в качестве контроля. Сортировка проводилась до суммарного количества клеток во всех фракциях 3 000 000 (тройной размер исходной библиотеки клонов). После раздельного выращивания фракций клеток, были измерены средние интенсивности флюоресценции во фракциях. В соответствии с ожиданиями, соотношение флюоресценции CER/RFP плавно возрастало от фракции к фракции, что свидетельствует об эффективном разделении клеток, содержащих плазмиды, колирующие 5’НТО с различной эффективностью трансляции. На следующем этапе будет проведено глубокое секвенирование рандомизированных участков из отобранных фракций. Таким образом, будет получен беспрецедентно большой набор вариантов 5’НТО с известной эффективностью трансляции. Получены ДНК-аптамеру к интерлейкину 6 (ИЛ6). Аптамеры - это небольшие фрагменты однотяжевой ДНК, специфически связывающиеся с белковой мишенью. С помощью метода SELEX проведена селекция комбинаторной библиотеки нуклеиновых кислот. С использованием метода поверхностного плазмонного резонанса, был выделен пул олигонуклеотидных последовательностей, обогащенный теми молекулами, которые имели небольшое сродство к белку ИЛ6. После клонирования и секвенирования были получены первичные структуры олигонуклеотидов, из которых была выбрана одна последовательность, охарактеризованная в реакции комплексообразования с ИЛ6. Проведена оценка устойчивости образовавшихся комплексов. Кажущаяся константа диссоциации составила 19нМ, что подтверждает высокое сродство данной молекулы к белку. Для сравнения у природного комплекса антиген-антитело константы диссоциации находятся в пределах 5-50нМ.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов.
Результаты этапа: В рамках тематики по поиску антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы проводилась работа, направленная на дизайн, синтез и изучение взаимодействия с рибосомой новых инструментов для исследования механизма регуляции трансляции, полученных на основе антибиотиков, специфически взаимодействующих с рибосомой в области А-сайта ее пептидилтрансферазного центра. Такие соединения представляют несомненный интерес как зонды для изучения регуляции функционирования рибосомы, а также как вещества, на базе которых могут быть созданы новые антибиотики. На основе имеющихся в литературе данных об атомной структуре комплексов этих антибиотиков с большой субъединицей рибосомы осуществляется работа по созданию соединений, которые способны, с одной стороны, образовывать прочные комплексы с рибосомой за счет собственно антибиотика или его фрагмента, выполняющих роль «якоря», а с другой, взаимодействовать с функционально важными сайтами рибосомного туннеля c помощью связанного с “якорем” заместителя (“щупа”). В качестве антибиотиков, играющих роль «якоря», в этих молекулах используются хлорамфеникол и цефалотаксин, связывание которых с А-сайтом ПТЦ рибосомы хорошо доказано. Заместители (“щупы”) в гибридных молекулах представлены аминокислотными, пептидными и другими радикалами, в том числе, гидрофобными, несущими положительный заряд, такими как, различные аргинин-содержащие пептиды, включая «стоп-пептиды», а также карнитины, бетаины и др. Выбор такого рода заместителей основывается как на литературных данных последних лет, так и на наших собственных результатах, касающихся взаимодействия элементов рибосомного туннеля с боковыми цепями растущей полипептидной цепи. В 2015 г. методом молекулярной динамики осуществлено моделирование прокариотических рибосом в области рибосомного туннеля и их комплексов со стоп-пептидами из последовательностей белка SecM. Получен ряд производных хлорамфеникола и цефалотаксина, содержащих в структуре остатки положительно заряженных аминокислот, определены константы связывания синтетических производных антибиотиков с рибосомой E.coli, а также ингибирующая активность в прокариотических и эукариотических системах трансляции. Выявлены наиболее активные в указанных тестах соединения, перспективные для их дальнейшего изучения методом рентгено-структурного анализа в комплексах с рибосомами. Была проведена сортировка клеток, трансформированных библиотекой плазмид с рандомизированными участками в 20 нуклеотидов в 5’-НТО перед стартовым кодоном гена CER. После сортировки клетки выращивали не менее 16 часов при интенсивном перемешивании и оценивали соотношение флуоресценции CER/RFP, нормирую на контрольное значение отношения для исходной плазмиды. Клетки из каждой отдельной фракции были собраны. Из них были выделены плазмиды, для которых затем проведена ПЦР с праймерами, фланкирующими с двух сторон участки рандомизации. После чего полученные последовательности отправлялись на глубокое секвенирование на Ion Torrent. Полученные после секвенирования последовательности, принадлежащие каждой из 8 фракций, были, во-первых, отсортированы по длине для отбора только тех из них, которые удовлетворяют необходимому размеру для достоверного детектирования в них начального участка кодирующей последовательности гена белка CER и участка, предшествующего рандомизированному в 5’-НТО. Во-вторых, проводилось множественное выравнивание отобранных сиксенсов для поиска всех полученных последовательностей, предшествующих стартовому кодону, длиной 20 нт, соответствующей участкам рандомизации. Таким образом, было получено чуть больше 6000 уникальных последовательностей. Каждая такая последовательность встречалась по 10-100 раз подряд в одной или двух фракциях, и их было преобладающее большинство, для некоторых иногда находилось около 1500 повторов в одной фракции. Для оценки вероятности встречаемости каждого типа нуклеотидов в полученных библиотеках был подсчитан процент A, T, G, C во всех отобранных уникальных последовательностях рандомизированных участков. Наименее представленным нуклеотидом в полученных участках рандомизации является цитозин, который чаще всего встречается во фракциях с низким отношением CER/RFP в наших библиотеках. По мере уменьшения количества С от фракции F1 к F8 число T также снижается, но значительно медленнее. В то же время для A и G наблюдается обратная картина – их число возрастает при том же направлении от F1 к F8, причем количество A быстрее увеличивается относительно количества G. Кроме анализа долей нуклеотидов в полученных массивах последовательностей был проведен поиск мотивов, расчет вторичных структур и построена модель факторов, влияющих на эффективность экспрессии. Семь полученных на предыдущем этапе 30-32- звенных олигонуклеотидных последовательностей (аптамеров) были охарактеризованы по сродству к белку интерлейкину 6 (ИЛ6). Для этого была проведена наработка аптамеров в количестве, достаточном для дальнейшего изучения. Аптамеры были очищены и тестированы ВЭЖХ. Ряд аптамеров был охарактеризован спектрами кругового дихроизма, которые показали присутствие структур параллельного квадруплекса. Было проведено комплексообразование с белком ИЛ6. С помощью метода проточной цитофлуориметрии было изучено влияние одного из полученных ДНК-аптамеров на образование сигнального комплекса с клеточными рецепторами, показано, что выбранный аптамер конкурирует с флуоресцентными антителами за связывание с интерлейкином-6.
4 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов.
Результаты этапа: На данном этапе исследования проводились по следующим направлениям: 1) Исследование комплексов бактериальных рибосом молекулярно-динамическими и экспериментальными методами: Молекулярно-динамические исследования бактериальных рибосом и их комплексов с антибиотиками и стоп-пептидами. Синтез пептидных аналогов десмикозина и хлорамфеникола, содержащих фрагменты антибактериальных пептидов онкоцинов. Рентгеноструктурный анализ аминокислотных аналогов хлорамфеникола, проявивших наиболее интересную биологическую активность. 2) Изучение 5'-нетранслиремых областей мРНК: Выборочная проверка эффективности трансляции для тех вариантов 5’-НТО, для которых измеряемая эффективность сильно отличается от предсказанной. Мутагенез выбранных 5’-НТО для выявления нуклеотидных остатков, наиболее сказывающихся на эффективности трансляции. 3) ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов Исследование комплексов полученных на предыдущем этапе ДНК-аптамеров с белком ИЛ6 - аналогов природного нуклеопротеидного комплекса, с привлечением различных физико- химических методов. Исследование комплексов бактериальных рибосом молекулярно-динамическими и экспериментальными методами. В процессе молекулярно-динамические исследования бактериальных рибосом и их комплексов с антибиотиками и стоп-пептидами с целью выяснения природы взаимодействий, лежащих в основе механизмов регуляции трансляции, был выполнен анализ траекторий комплексов рибосомы E. coli cо стоп-пептидами. Проведена кластеризация конформаций SecM и остатков стенок рибосомного туннеля, выделены три основных кластера. В первом кластере остаток аспарагиновой кислоты 11 в SecM координирует ион магния вместе с фосфатом G1259, занимая три координационные позиции (Рис. 1). В другом - остаток триптофана 18 в SecM занимает центральное место в стопке, вступая в стэкинг с гетероциклическим основанием урацила 790 и пи-катионные взаимодействия с гуанидиновой группой аргинина 63 (Рис. 2). Анализ водородных связей показывает особую роль C-концевых остатков SecM - Arg-26, Ala27, Gly28 (RAG) - возникает сеть водородных связей, особенно сильные взаимодействия дает аргинин-26, который образует прочные водородные связи с O5' G2505. То же можно сказать об остатках Ser14, Val17, Trp18, Gln21. Анализ энергии взаимодействий подтверждает роль указанных аминокислотных остатков во взаимодействии пептида с РТ. Рис. 1. Рис. 2. Экспериментальная работа по созданию антибактериальных соединений была направлена на синтез пептидных аналогов десмикозина и хлорамфеникола, содержащих фрагменты антибактериальных пептидов онкоцинов. Для этого синтетическим путем были получены ключевые соединения для модификации их аминокислотными и пептидными производными. Из антибиотика тилозина путем его тотального ацетилирования с последующим мягким гидролизом было получено диацетильное производное десмикозина, содержащее свободную 4’-гидроксильную группу, предназначеную для конъюгации с пептидами. Из хлорамфеникола был получен хлорамфениколамин, который был модифицирован дикарбоксильными линкерами различной длины для последующещего присоединения пептидов, содержащих остатки аргинина и пролина, через аминогруппу пептида. Был проведен рентгеноструктурный анализ (совместно с Ю. Поликановым, University of Illinois, Chicago, USA) комплексов 70S рибосом Thermus thermophilus с аминокислотными аналогами хлорамфеникола, содержащими остатки положительно-заряженных аминокислот и проявившими наиболее интересную биологическую активность (таблица 1). Показано, что His-CAM взаимодействует с основанием U2506 и формирует с ним смещенный стэкинг, кроме того, при этом взаимодействии возникает сеть водородных связей через одну молекулу воды, которая в свою очередь взаимодействует с фосфатом G2505 (Рис. 3). Таблица 1. Рис. 3. Изучение 5'-нетранслиремых областей мРНК Для того, чтобы выявить новые элементы мРНК, влияющие на эффективность трансляции, мы выбрали три 5'-НТО с необъяснимо высокой эффективностью трансляции для детального анализа с помощью мутаций. Среди мРНК, принадлежащих к наиболее эффективным, мы обнаружили мРНК с 5'-НТО обогащенной остатками аденина (таблица 2, А-богатая 5'-НТО) и последовательностью SD не более 4 нт. Для того, чтобы изучить этот 5’-НТО в деталях, мы создали репортерную плазмиду, содержащую эту последовательность 5'-НТО перед геном флюоресцентного белка CER. Измеренная эффективность трансляции этой мРНК оказалась в шесть раз выше, чем контрольная мРНК гена RFP, закодированная в той же репортерной конструкции (таблица 2, контроль). А-богатая 5'-НТО содержала две коротких SD-последовательности (AAGG и GGA) и дополнительный AUG кодон, расположенные в рамке с геном CER. Мутация дополнительного AUG-кодона снизила эффективность трансляции приблизительно в два раза (таблица 2, А-богатая 5'-НТО noAUG), указывая, что дополнительный стартовый кодон может быть использован для инициации трансляции в дополнение к основному. Замена более короткой последовательности SD, GGA на ААА (таблица 2, А-богатая 5'-НТО -2G) привела к 1.3-кратному снижению эффективности трансляции, что свидетельствует о минимальном влиянии этой короткой SD последовательности на эффективность трансляции. Мутации обеих SD последовательностей и дополнительного AUG кодона приводят к 16-кратному снижению эффективности трансляции (таблица 2, A-богатая 5'-НТО -5G). Следует отметить, что последний мутант имеет не более двух нуклеотидов, комплементарных 3'-концевой области 16S рРНК, но его эффективность трансляции по-прежнему на порядок выше, чем для других репортерных мРНК с 2 нт SD последовательностью. Таким образом, эффективность трансляции мРНК с А-богатой 5'-НТО можно было бы объяснить аддитивным действием двух SD последовательностей (вклад одной существенно больше), дополнительным AUG-кодоном и неизвестных элементов последовательности, которые увеличивают эффективность трансляции в дополнение к перечисленным выше. Интересно, что А-богатая 5'-НТО имеет заметно уменьшенное число остатков цитозина, как и многие 5'-НТО с высокой эффективностью трансляции. Другая необычайно эффективная мРНК имела 4 нт последовательность SD (таблица 3, короткая SD 5'-НТО), расположенную на расстоянии 13 нт от AUG. Модельная мРНК с похожей длиной и расположением SD (таблица 3, 4/13) была почти на два порядка менее эффективной. В эту 5'-НТО были внесены мутации (таблица 3), чтобы идентифицировать области, которые влияют на трансляцию. Чтобы проверить возможность того, что необычно эффективная трансляция мРНК с короткой SD обусловлена дополнительным GUG кодоном, который может выступать в качестве потенциального старт-кодона, мы превратили его в GUC и GCG (таблица 3, короткая SD-GUC и короткая SD-GCG). Отсутствие или незначительное снижение эффективности трансляции в результате этих замен говорит в пользу несущественности этого GUG кодона для эффективности трансляции. Мутации последовательности SD (таблица 3, короткая SD 5'-НТО -SD) привели к полной инактивации трансляции. Тем не менее, мутации 5'-проксимальной области, в результате чего последовательность SD осталась нетронутой, снизили трансляцию в той же степени (таблица 3, короткая SD 5'-НТО -9UA). Даже замена трех остатков уридина значительно уменьшила эффективность трансляции (таблица 3, короткая SD 5'-НТО-3U). Мутации в области между последовательностью SD и старт-кодоном лишь умеренно понизили эффективность трансляции (таблица 3, короткая SD 5'-НТО-3 '). Перемещение последовательности SD ближе к стартовому кодону (таблица 3, короткая SD-5'-НТО + SD), которое в случае модельной 5’-НТО с последовательностью SD 4 нт было благоприятно (таблица 3, 4/7), снижало трансляцию мРНК м короткой SD более чем в пять раз. Неожиданно высокая эффективность трансляции этой 5'-НТО можно объяснить комбинацией трансляционных энхансеров. Следует отметить, что эффективность трансляции этой 5'-НТО весьма чувствительна к мутациям. Оказалось, что не только наличие, но и специфическое для данной 5'-НТО расположение последовательности SD очень важно для эффективности трансляции. U-богатая последовательность, расположенная c 5’-стороны от SD работала как энхансер трансляции, судя по эффективности трансляции короткой SD 5'-НТО-3U и короткой SD 5'-НТО -9UA мутантов. Третья 5'-НТО с неожиданно высокой эффективностью трансляции содержала шесть AG повторов (таблица 4, AG-богатая 5'-НТО). Кроме того, в ней содержится GGAG последовательность, сходная с SD, но расположенная на большом расстоянии (20 нт) до AUG старт-кодона, что позволяет сомневаться в ее эффективной работе, как SD последовательности. Эта репортерная мРНК весьма эффективно транслировалась (таблица 4, AG-богатая 5'-UTR), в 5 раз более эффективно, чем контрольная мРНК RFP (таблица 4, контроль). Мутации, которые нарушают первые (таблица 3, AG-богатая 5'-UTR -AG1-3) и последние (таблица 4, AG-богатая 5'-UTR -AG4-6) три повтора AG привели к снижению эффективности трансляции в 34 и 3,6 раза, соответственно. Одним из возможных вариантов было то, что последовательность GAG в повторах AG может служить последовательность SD. Мы мутировали проксимальный (таблица 4, AG-богатая 5'-UTR + SD1) и дистальный (таблица 4, AG-богатая 5'-UTR + SD2) части последовательности AG повтора, чтобы создать более сильные последовательности SD AGGAG и GGAGG. Удивительно, но введение последовательности SD в любом из этих двух положений снижало эффективность трансляции примерно в 3,3 раза (таблица 4). Более того, даже устранение одного G в середине области AG повтора (таблица 4, AG-богатая 5'-UTR -G) уменьшало трансляцию в 4,5 раза. Таким образом, область AG-повтора служит уникальным энхансером трансляции. Даже после устранения наиболее функционально важной части (таблица 3, AG-богатая 5'-UTR -AG1-3) остаточную эффективность трансляции была значительно выше, чем у искусственного мРНК-репортера (таблица 4, 4/16), содержащего сопоставимую последовательность SD. Таблица 2. Таблица 3. Таблица 4. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов Для оценки сродства аптамеров к белку ИЛ6 использовали метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР), который является чувствительным методом для характеристики комплексообразование белков с нуклеиновыми кислотами. В ППР используют чипы с тонкими золотыми пленками, на которых присутствует мономолекулярный слой "лиганда". Это слой органических молекул, которые избирательно взаимодействуют с "аналитом" – теми молекулами, которые протекают через этот чип в потоке. Детектором поверхностного плазмонного резонанса служит специальное оптическое устройство, рабочая поверхность которого находится в непосредственном физическом контакте с исследуемым образцом. Когда молекулы аналита присоединяются к молекулам лиганда, создаваемое последними электрическое поле на поверхности металла несколько изменяется, вследствие чего кривая ППР смещается. Сдвиг этот тем больше, чем больше молекул аналита присоединилось к биочувствительному слою лиганда. А это зависит от концентрации аналита в исследуемом растворе и от кинетики процессов биохимического взаимодействия аналита с лигандом. Для связывания ДНК-аптамеров с интерлейкином использовали буфер следующего состава: 20 mM МЕS-KOH, pH=6,2, 140 mM NaCl, 5mM KCl. В цикле измерений проточную ячейку и чувствительную поверхность сначала промывали несколько минут буферным раствором. Потом присоединяли молекулы ИЛ6, обрабатывая чип смесью растворов 0,4М 1-этил-3(3-диметиламинопропил)-карбодиимида с 0,1М N-гидроксисукцинимида. Количество присоединенного белка оценивали по разнице концентраций белка до и после посадки (приблизительно 100 пикомолей). Далее в аналите пропускали растворы аптамеров одинаковой концентрации. Рис. 4. Из графиков четко видно, что наибольшую амплитуду имеют сенсограммы для аптамеров 110 и 166, что свидетельствует о наибольшем сродстве данных аптамеров в изучаемом ряду молекул. Кажущиеся константы диссоциации находятся в интервале 100-600 нМ.
5 1 января 2017 г.-1 декабря 2017 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов.
Результаты этапа: Объектом исследования данной НИР является взаимодействие нуклеиновых кислот (рРНК, мРНК, ДНК-аптомеров) с пептидами, белками, либо антибиотиками. НИР направлена на получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы и создание терапевтических агентов на основе ДНК-аптамеров. Одним из подходов к реализации этой цели является дизайн, синтез и изучение взаимодействия с рибосомой новых инструментов для исследования механизма регуляции трансляции, полученных на основе антибиотиков, специфически взаимодействующих с рибосомой в области пептидилтрансферазного центра и рибосомного туннеля. Другим подходом к изучению механизмов регуляции трансляции является исследование влияния последовательностей Шайн-Дальгарно мРНК на эффективность трансляции с помощью нового метода Flowseq, сочетающего использование рандомизированных участков инициации трансляции, сортировки клеток и высокопроизводительного секвенирования. Взаимодействие НК с белками в данной работе исследуется на примере ДНК-аптамеров, высокая специфичность и аффинность которых к белковым мишеням делает их перспективными соединениями для создания терапевтических агентов. При выполнении НИР использованы, как теоретические расчетные методы (молекулярная динамика), так и экспериментальные методы (органический синтез, физико-химические, биохимические). Для изучения методом молекулярной динамики согласованности движения тРНК в процессе синтеза белка по трем сайтам пептидилтрансферазного центра подготовлены и оптимизированы системы, содержащие А и Р тРНК («АР» и «РЕ» системы), а также системы с тремя каноничными тРНК («ЕРА» система). Методом МД удалось обнаружены два различных конформационных состояния спирали Н92 23S РНК (А-спирали). С применением метода поляризации флуоресценции показано, что базовые соединения для синтеза пептидных производных десмикозина связываются с рибосомы E.coli достаточно прочно для того, чтобы на из основе были созданы инструменты для изучения взаимодействий в РТ. Осуществлен синтез аналогов десмикозина, содержащих фрагменты антибактериальных пептидов онкоцинов. При изучении 5'-нетранслиремых областей мРНК установлено, что образование вторичной структуры и наличие редких кодонов в мРНК препятствует трансляции. Гипотезу о том, что редкие кодоны в начале кодирующей области способствуют трансляции, необходимо отвергнуть. Получены полиэлектролитные комплексы на основе протамина; исследованы характеристики ДНК-аптамера в полиэлектролитных комплексах (ПЭК) с протамином и его способность ингибировать тромбин;получена форму с пролонгированным высвобождением ДНК-аптамера из ПЭК на животных моделях in vivo. Показано, что жесткая термостабильная квадруплексная область RE31 и Nu172, стабилизированная присутствием дуплекса, может поддерживать структуру, предназначенную для связывания и ингибирования тромбина также в присутствии большого избытка натрия. Установлено, что АТР-зависимая Lon-протеаза из E. coli способна к образованию прочных комплексов с рядом ДНК-аптамеров. Все запланированные результаты получены. Уровень исследования и полученных результатов сопоставим с мировым. Результаты могут найти применение при создании антибактериальных веществ, а также терапевтических агентов класса антикоагулянтов.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов.
Результаты этапа: Исследование комплексов бактериальных рибосом молекулярно-динамическими и экспериментальными методами. В процессе изучения рибосомы накопилось множество сведений о дистанционной согласованности ее элементов, или аллостерии: так, например, элонгационный фактор G, связываясь с L7/L12 протуберанцем, регулирует состояние другого протуберанца L1 на противоположном фланге большой субъединицы рибосомы на расстоянии около 170 Å; или ГТФазная активности факторов трансляции регулируется связыванием тРНК в Е-сайт большой субъединицы, удаленном на 120 Å. С целью прояснения механизмов аллостерической регуляции в рибосоме на уровне отдельных остатков и конкретных взаимодействий в процессе синтеза белка по трем сайтам пептидилтрансферазного центра на предыдущем этапе были подготовлены и оптимизированы системы для расчетов молекулярной динамики (МД), содержащие А и Р тРНК («АР» и «РЕ» системы), а также системы с тремя каноничными тРНК («ЕРА» система). Было также обнаружено два различных конформационных состояния А-спирали и показано, что эти состояния тесно связаны с состояниями других функциональных элементов рибосомы. На данном этапе проекта методами молекулярнно динамики исследован Е-сайт рибосомы, а также возможный путь передачи аллостерических сигналов от синтезируемой пептидной цепи к пептидилтрансферазному центру. тРНК взаимодействует с рибосомой в Е-сайте двумя концевыми остатками: А76 встраивается в стопку-дополнение ко спирали Н88 и образует две водородные связи с С2394, С75 образует стэкинг с универсально консервативной стопкой (Рис. 1). Связывание тРНК стабилизирует взаимодействия этой стопки, во-первых, с узлом, с которого начинаются спирали 11 и 28, а, во-вторых, с универсально консервативным узлом между спиралями 74 и 75: в АР-состояниии эти связи разрушены. Связывание Е-тРНК вызывает изгиб консервативного узла на границе Н74 и Н75, состоящем из хугстиновских троек, что выливается в небольшую перегруппировку связей: U2245 воспроизводимо и стабильно разрушает связь с G2536 и образует связь с А2435, частично вытесняя U2245 из этого взаимодействия. В АР-состоянии подобной перегруппировки не наблюдается. Таким образом, связывание Е-тРНК также вызывает перегруппировку связей в сайте и его окрестностях, причем основной эффект — от стэкинга А2432 и С75. На рисунке 2 приведены встречаемость связей т. н. переключателей в окрестностях А- и Е- сайтов. Видно, что переключателей вокруг А-сайта больше, и эффект от них практически 100%-ый, в то время как переключателей в Е-сайте намного меньше и они слабее, однако, эти эффекты также воспроизводятся во всех пересчетах траекторий. Рисунок 1. Взаимодействие тРНК с рибосомой в Е-сайте. Рисунок 2. Встречаемость связей т. н. переключателей в окрестностях А- и Е- сайтов. Присутствие трех тРНК в классических сайтах нарушало геометрию связывания как А-, так и Е-тРНК. И, помимо прочего, в ПТЦ потенциальные участники ПТР не удерживались вместе на том же расстоянии, на котором стабильно находятся в классическом АР-состоянии (Рис. 3). Таким образом, можно действительно говорить об отрицательной кооперативности между А и Е сайтами: связывание тРНК в Е-сайте дестабилизирует связи тРНК с А-сайтом, и наоборот. Рисунок 3. Присутствие трех тРНК в классических сайтах нарушает геометрию связывания как А-, так и Е-тРНК. Согласно экспериментальным данным, пептид, связанный с Р-тРНК в рибосомном туннеле, способен влиять на стабильность Е-тРНК. Е-сайт, в свою очередь, согласно нашим предыдущим данным, отрицательно взаимосвязан с А-сайтом. Поэтому было решено исследовать влияние пептида на Р-тРНК на оба эти сайта. С применением докинга и оптимизацией короткими расчетами МД получены системы, содержащие в РТ на Р-тРНК как короткие фрагменты белков, в присутствие которых связывание Е-тРНК с рибосомой стабильно, так и короткие пептиды, о которых достоверно известно из литературы, что они способствуют диссоциации тРНК из Е-сайта (Рис. 4). Состояние А-сайта в присутствие коротких фрагментов в туннеле, оказалось идентичным РЕ состоянию: основание С2610 формирует обращенную Уотсон-Криковскую пару с G2505, и эта пара стабильно связана с А-сайтом сетью стэкингов и водородных связей. Присутствие пептида в туннеле, размеры которого позволяют дотянуться до пары 2610-2505, дестабилизируют эту пару, а с нею — и последовательность связей, ведущих к А-сайту, так, что вершина А-спирали оказывается нарушена. Таким образом, можно сказать, что рассмотренные пептиды дестабилизируют РЕ-состояние, смещая этим равновесие по направлению к АР-состоянию. Рисунок 4. Короткий пептидный фрагмент в рибосомном туннеле. Таким образом, методом МД показано, что (а) передача аллостерических сигналов в рибосоме осуществляется за счет изменения невалентных взаимодействий оснований нуклеотидных остатков рРНК; при этом легко перестраивающиеся участки рРНК перемежаются плотно упакованными стабильными элементами ее макромолекулы, что позволяет превращать микроизменения в макросмещения в структуре рибосомы; (б) между каноничесими А- и Е-сайтами рибосомы существует отрицательная аллостерическая взаимосвязь: одновременное присутствие тРНК в А и Е сайтах 70S рибосомы неизбежно ведет к искажению геометрии связывания как минимум одной из этих тРНК и расхождению субстратов пептидилтрансферразной реакции на расстояние, исключающее ее; (в) молекулярно-динамическое моделирование позволяет конкретизировать роль вновь синтезируемого пептида в стабилизации/дестабилизации связывания тРНК в Е-сайте рибосомы. Экспериментальная работа по созданию антибактериальных соединений была направлена на изучение аналогов десмикозина, содержащих фрагменты антибактериальных пептидов онкоцинов. Полученные соединения были протестированы на связывание с рибосомами E.coli по вытеснению флуоресцентно-меченного макролидного антибиотика из его комплексов с рибосомой. Оказалось, что пептидные аналоги десмикозина связываются с рибосомой E.coli. Кроме того, полученные соединения были протестированы в двойной репортерной сиситеме на антибиотическую активность, результаты показывают, что механизм действия синтезированных соединений связан с остановкой трансляции (Рис. 5). Рисунок 5. Исследование взаимодействия производных десмикозина с бактериальными рибосомами. Изучение влияния метилирования рРНК на ингибирующую способность антибиотиков вызывать остановку рибосомы. Поиск новых антибиотиков, нарушающих синтез белка, среди природных образцов: Метилирование нуклеотидов в рибосомных РНК (рРНК) является общей особенностью, которая встречается во всех живых организмах. Идентификация всех ферментов, ответственных за метилирование рРНК, а также картирование всех модифицированных остатков рРНК теперь завершено для ряда модельных видов, таких как Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. Недавние структуры с высоким разрешением бактериальных рибосом обеспечивали первую прямую визуализацию метилированных нуклеотидов. В последнее время стали доступны структуры рибосом от различных организмов и органелл, что позволяет проводить сравнительный структурный анализ сайтов метилирования рРНК в различных таксономических группах. В дополнение к консервативному ядру модифицированных остатков в рибосомах из большинства изученных организмов структурный анализ указывает на функциональные роли некоторых метилирования рРНК, которые важны в эволюционном контексте (Рис. 6). Рисунок 6. Модификации сайтов в рибосомных РНК. Пространственное распределение модифицированных нуклеотидов в структурах малых (левых) и больших (правых) рибосомных субъединиц из разных таксономических групп: (a, b) Escherichia coli (запись PDB 4YBB19), (c, d) Saccharomyces cerevisiae (запись PDB 4V8820) , (e, f) Homo sapiens (запись PDB 4UGO21) и (g, h) митохондрии человека (запись PDB 3J9M23). Универсально сохраненные сайты метилирования, которые одинаковы среди всех таксономических групп, показаны в темно-синем. В ходе работы был проведен поиск новых антибиотиков, нарушающих синтез белка, среди природных образцов. Эндофитные актинобактерии являются одним из важных фармацевтических ресурсов и хорошо известны для производства различных видов биологически активных веществ. В исследовании было собрано пять различных растений мангровых лесов из Национального природного заповедника Бейлун в Гуанси-Чжуанском автономном округе, Китай. В общей сложности 63 из 101 штамма были выбраны для скрининга антибактериальной активности методом диффузии в агаре с помощью двойной репортерной системы pDualrep2 (Рис. 7). В общей сложности 31 штамм показал положительные результаты, по крайней мере, в одном антибактериальном анализе. Примечательно, что штамм 8BXZ-J1 и три других новых новых вида, 7BMP-1, 5BQP-J3 и 1BXZ-J1, показали антибактериальную активность. Кроме того, 21 штамм показал ингибирующую активность по меньшей мере для одного из «устойчивых» ESKAPE возбудителей. Мы также обнаружили, что образцы 2BBP-J2 и 1BBP-1 продуцируют биологически активное соединение с ингибирующей активностью по биосинтезу белка. Между тем, штамм Streptomyces 3BQP-1 продуцирует биологически активное соединение, индуцирующее SOS-ответ из-за повреждения ДНК. В заключение, это исследование показало, что мангровые растения содержат большое разнообразие культивируемых эндофитных актинобактерий, которые могут стать многообещающим источником для обнаружения новых видов и биологически активных соединений. Рисунок 7. Индукция двухцветной двойной репортерной системы, чувствительной к ингибиторам трансляции или ингибиторам репликации ДНК, соответственно. Капли эритромицина (ERY), левофлоксацина (LEV) и тестируемые соединения помещались на поверхность пластины агара, содержащей клетки E.coli tolC, трансформированные репортерной плазмидой pDualrep2. Показана флуоресценция лужайки клеток E.coli, отсканированных при 553/574 нм (зеленый псевдоцвет) для флуоресценции RFP и 588/633 нм (красный псевдоцвет) для флуоресценции Katushka2S. Индукция экспрессии Katushka2S запускается ингибиторами трансляции, тогда как RFP активируется путем индукции ответа SOS на повреждение ДНК. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов Внутрисосудистое тромбообразование приводит к развитию серьезных заболеваний: инсульты, инфаркты миокарда, послеоперационные осложнения и др. В настоящее время для лечения используются антикоагулянты - препараты, действующие на свертывающую систему крови и ингибирующие образование фибрина. Центральным белком свертывания крови является тромбин. В настоящее время получены ДНК аптамеры, длиной 30-60 нуклеотидов молекулы, которые ингибируют избыточную активность тромбина. Была поставлена задача получить биоустойчивые аптамеры, которые могут длительное время (часы) находиться в кровотоке без разрушения и выведения из организма. На предыдущих этапах был получен и исследован ряд аптамеров второго поколения, структура которых включает, как G-квадруплекс, так и дуплексный домен: RE31, Nu172, HD22-27mer и HD22-29mer. В отчетном году была проведена отработка методики дизайна структур ДНК аптамеров методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) (совместно с сотрудниками НИЦ "Курчатовский институт" на установке синхротронного излучения). Подход состоял из четырех этапов: (i) получение экспериментальных данных SAXS RE31аптамера в растворе, (ii) построение модели распределения масс по отношению к центру масс в молекуле с использованием SAXS, (iii) построение трехмерной модели аптамера в соответствии с его нуклеотидной последовательностью (первичная структура) и вторичной структурой и (iv) сравнение и уточнение соответствия путем математического моделирования 3D структур и с экспериментальной моделью SAXS. В доказательстве корректности подхода были проанализированы 3D структуры аптамера RE31 в свободном состоянии до комплексообразования с тромбином при разных температурах и с подтверждением спектрами кругового дихроизма (CD). В приведенной 3D-структуре RE31 обладает наиболее энергетически выгодной конформацией, как и составляющие элементы, дуплексный домен, некомплементарные области (шарнир) и два G-квартета, о которых ранее сообщалось по результатам рентгеновской дифракции (XRD) монокристалла (Рис. 8). Рисунок 8. Общая схема нахождения трехмерной структуры аптамера RE31 с помощью SAXS и молекулярного моделирования. (I) получение экспериментальных данных SAXS аптамера в растворе, (II) построение модели распределения масс по отношению к центру масс в молекуле с использованием результатов SAXS, (III) построение трехмерной модели аптамера по его нуклеотидной последовательности и вторичной структуре, (IV) сравнение и уточнение математического моделирования 3D структуры с экспериментальной моделью SAXS (красный цвет - молекулярное моделирование, синий цвет – по данным SAXS). Заключение В результате выполнения НИР в 2018 году: 1) Методами молекулярной динамики осуществлено моделирование рибосомы в комплексе с тремя тРНК, исследован возможный путь передачи аллостерических сигналов от синтезируемой пептидной цепи к пептидилтрансферазному центру. Показано, что: а) передача аллостерических сигналов в рибосоме осуществляется за счет изменения невалентных взаимодействий оснований нуклеотидных остатков рРНК; при этом легко перестраивающиеся участки рРНК перемежаются плотно упакованными стабильными элементами ее макромолекулы, что позволяет превращать микроизменения в макросмещения в структуре рибосомы; б) между каноничесими А- и Е-сайтами рибосомы существует отрицательная аллостерическая взаимосвязь: одновременное присутствие тРНК в А и Е сайтах 70S рибосомы неизбежно ведет к искажению геометрии связывания как минимум одной из этих тРНК и расхождению субстратов пептидилтрансферразной реакции на расстояние, исключающее ее; в) молекулярно-динамическое моделирование позволяет конкретизировать роль вновь синтезируемого пептида в стабилизации/дестабилизации связывания тРНК в Е-сайте рибосомы. 2) С применением метода поляризации флуоресценции исследован ряд синтетических пептидных аналогов десмикозина, содержащих фрагменты антибактериальных пептидов онкоцинов, показано, что эти аналоги связываются с рибосомой в наномолярном диапазоне. 3) Проведена идентификация всех ферментов, ответственных за метилирование рРНК, а также картирование всех модифицированных остатков рРНК в E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и митохондриях человека. 4) Осуществлен поиск новых антибиотиков, нарушающих синтез белка, среди природных образцов из растений мангровых лесов Национального природного заповедника Бейлун в Гуанси-Чжуанском автономном округе, Китай, найден ряд образцов с ингибирующей активностью по биосинтезу белка, а также по механизму, связанному с индукцией SOS-ответа на повреждение ДНК. 5) Отработана методика дизайна структур ДНК аптамеров методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) на установке синхротронного излучения. Все запланированные результаты получены. Уровень исследования и полученных результатов сопоставим с мировым. Ранее авторами НИР на основании анализа структурных данных была выдвинута идея синтеза пептидных производных антибиотиков макролидов, в которых пептидная часть имитирует растущую цепь белка, а макролид служит «якорем» для закрепления в специфическом участке РТ. Идея создания таких соединений, представляющих интерес не только как модельные для изучения функционирования рибосомы, но и как вещества, на основе которых могут быть созданы новые антибиотики, является приоритетной: до этого момента подобные соединения в литературе описаны не были. Область исследования рибосомы методом молекулярной динамики возникла совсем недавно, около десяти лет назад, и насчитывает не так много работ. Применяемые в данной НИР подходы: расчетный (моделирование молекулярной динамики комплексов бактериальных рибосом c антибиотиками и стоп-пептидами) и экспериментальный (использование пептидных производных рибосомных антибиотиков), позволяют получать прямые данные о взаимодействии растущей пептидной цепи с “сенсорными” участками рибосомы – важными элементами системы регуляции экспрессии генов на уровне трансляции. Метилирование нуклеотидов в рибосомных РНК (рРНК) является общей особенностью, которая встречается во всех живых организмах. Идентификация всех ферментов, ответственных за метилирование рРНК, а также картирование всех модифицированных остатков рРНК теперь завершено для ряда модельных видов прокариот и эукариот. В дополнение к консервативному ядру модифицированных остатков в рибосомах из большинства изученных организмов структурный анализ указывает на функциональные роли некоторых метилирования рРНК, которые важны в эволюционном контексте. Эндофитные актинобактерии являются одним из важных фармацевтических ресурсов и хорошо известны для производства различных видов биологически активных веществ. С помощью разработанной нами двойной репортерной системы pDualrep2 методом диффузии в агаре проведен поиск новых антибиотиков, нарушающих синтез белка, среди природных образцов из пяти различных растений мангровых лесов из Национального природного заповедника Бейлун в Гуанси-Чжуанском автономном округе, Китай. В результате скрининга найден ряд образцов, обладающих антибактериальной активностью; образцы дифференцированы по механизму дейчтвия, содержащихся в них антибактериальных веществ. Исследование показало, что мангровые растения содержат большое разнообразие культивируемых эндофитных актинобактерий, которые могут стать многообещающим источником для обнаружения новых видов и биологически активных соединений. Специфичность и аффинность аптамеров, небольших фрагментов ДНК/РНК, выделенных селекцией,к белковым мишеням высоки и сравнимы со сродством моноклональных антител к этим же белкам. Создание аптамеров к тромбину, центральному белку процесса свертывания крови, является перспективным направлением для их использования в терапии, как основы для создания ингибиторов сосудистого тромбообразования, которое приводит к развитию таких опасных заболеваний, как инфаркт миокарда, ишемический инсульт и т.д.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов.
Результаты этапа: На данном этапе исследования проводились по следующим направлениям: 1) Исследование комплексов бактериальных рибосом молекулярно-динамическими и экспериментальными методами: Синтез и исследование синтетических аналогов хлорамфеникола, содержащих фрагменты антимикробных пептидов на их способность связываться с рибосомой расчетными и биохимическими методами. 2) Изучение влияния метилирования рРНК на ингибирующую способность антибиотиков вызывать остановку рибосомы. Выделение фрагментов мРНК, защищенных рибосомами, остановленными антибиотиками на различных мРНК. Пробное секвенирование выделенных фрагментов. 3) ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов Дизайн и изучение G- квадруплексных структур антипараллельных аптамеров к тромбину совместно с сотрудниками НИЦ "Курчатовский институт" на установке синхротронного излучения. Исследование комплексов бактериальных теоретическими и экспериментальными методами. Антимикробные пептиды онкоцины связываются в рибосомном туннеле бактерий и ингибируют процесс элонгации трансляции. При этом пептид располагается в обратной ориентации относительно полипептида, синтезируемого самой рибосомой, – N-конец онкоцина связывается в ПТЦ, а С-конец направлен к выходу из рибосомного туннеля, полностью его блокируя. Область связывания онкоцина перекрывается с сайтом связывания хлорамфеникола, дихлорацетильный остаток которого направлен в сторону рибосомного туннеля. Сочетание хлорамфениколамина с С-концевыми фрагментами онкоцина ведет к получению новых химерных молекул, с помощью которых можно изучать строение РТ и механизмы регуляции трансляции. Подобные соединения, действие которых направленно сразу на несколько сайтов в бактериальной рибосоме, также интересны с точки зрения разработки новых антибактериальных препаратов. Дизайн конъюгатов хлорамфениколамина с фрагментами онкоцина проводили с помощью статического моделирования. Для этого структуры хлорамфеникола и Onc112 в комплексах с рибосомами E. coli (PDB ID: 4V7T) [54] и T. thermophiles (PDB ID: 4Z8C), полученные методом рентгеноструктурнго анализа, были наложены друг на друга (Рис. 1). Хлорамфеникол в РТ располагается в месте связывания а.к. остатков Tyr6 и Leu7 Onc112, причем сайт связывания бензольного кольца хлорамфеникола перекрывается с сайтом связывания Tyr6, а дихлорацетильного остатка хлорамфеникола – с Leu7. Рисунок 1. Статическое моделирование: наложение рентгеноструктурных данных хлорамфеникола (CHL показан желтым) в комплексе с рибосомой E. coli (PDB ID: 4V7T) и онкоцина 112 (Onc показан голубым) в комплексе с рибосомой T. thermophilus (PDB ID: 4ZER). По результатам наложения рентгеноструктурных данных было предложено соединить аминогруппу хлорамфениколамина с α-иминогруппой Pro8. Наиболее оптимальная длина линкера составила 4 - 5 атомов углерода. Исходя из этого, в качестве линкеров были выбраны бутан- и пентандиовая кислоты, которые позволяют сохранить амидную связь хлорамфеникола. Для проверки предположения о связывании сконструированных конъюгатов хлорамфениколамина с С-концевыми фрагментами онкоцина в РТ, было проведено компьютерное моделирование взаимодействия данных производных с большой субъединицей рибосомы методом молекулярного докинга. Для этого было выбранно программное обеспечение «QuickVina 2», показывающее хорошие результаты для различных рецепторов и отличающееся высокой производительностью. В качестве рецепторов были использованы следующие кристаллические структуры: комплекс 70S рибосомы E. coli с хлорамфениколом (PDB ID: 4V7T), комплекс 70S рибосомы T. thermophiles с Onc112 (PDB ID: 4Z8C) и 70S рибосома E. coli (PDB ID: 4YBB). В качестве лигандов использовались конъюгаты хлорамфениколамина с С-концевыми фрагментами онкоцина, при этом варьировалась длина линкера от пропан- до гександиовой кислоты (-CO(CH2)nCO-, n=1-4). Лиганды, содержащие фрагменты онкоцина, длиной более 5 а.к., приводили к значительному увеличению количества подвижных связей в комплексе, что влекло к существенному росту времени расчета и ухудшению точности докинга, поэтому в дальнейшем молекулярный докинг проводили для лигандов с пептидными фрагментами длиной от одной до 5 а.к. Область молекулярного докинга в структуре рибосомы определялась как параллелепипед (40×30×30 Å), включающий сайты связывания хлорамфеникола и С-концевой области онкоцина. Из структур рибосом были удалены низкомолекулярные лиганды, молекулы воды и неорганические ионы, так как они не учитываются в процессе молекулярного докинга. Также в структурах рецепторов были добавлены полярные атомы водорода, чтобы учесть все водородные связи, и расставлены заряды. Для получения наиболее достоверных результатов докинга, параметр «exhaustiveness», характеризующий точность и полноту расчетов в программе «QuickVina 2», выбрали 600, учитывая рекомендацию авторов использовать значение 8 и более. В результате выполнения молекулярного докинга было получены по 20 конформаций для каждого из лигандов, ранжированных по энергии связывания.В рассчитанных структурах аминокислотные и пептидные производные хлорамфениколамина в основном находились в предполагаемых нами сайтах связывания – хлорамфениколамин в сайте связывания хлорамфеникола, а С-концевые фрагменты онкоцина были направлены к выходу из РТ (Рис. 2А). Как для структур с одинаковыми длинами линкера и различными пептидными фрагментами, так и для структур с одинаковой длиной пептида и различными линкерами, также наблюдались аналогичные состояния (Рис. 2 Б-В), однако наименьшее количество таких состояний наблюдалось для структур с гександиовым линкером (n=4). Рисунок 2. Положения различных производных хлорамфениколамина по результатам молекулярного докинга в рибосоме T. thermophilus (PDB ID: 4Z8C). Нумерация нуклеотидов приведена по рибосоме E. coli. Положение хлорамфениколамина приведено по структуре его комплекса с рибосомой E. coli (PDB ID: 4V7T) Из полученных результатов были выбраны конформации, в которых отклонение хлорамфениколамина от сайта связывания хлорамфеникола было минимально, а энергия взаимодействия с рибосомой – максимальна. Таким образом, молекулярный докинг позволил сделать предположение о том, что производные хлорамфениколамина с фрагментами онкоцина могут связаться рибосомой так, что нитрофенильная часть молекулы будет находится в сайте связывания хлорамфеникола, в то время как пептидный фрагмент направлен в сторону РТ. В дальнейшем с учетом моделирования были синтезированы производные хлорамфениколамина, содержащие трипептиды PRP и пентапептиды PRPRP через бутан- и пентандиовые линкеры (n=2-3). Также было синтезировано производное хлорамфениколамина, содержащее пентапептидный остаток ProArgProArgPro, соответствующий по последовательности фрагменту 8-12 онкоцина, однако с обратным направлением пептидной цепи. Для получения пептидных производных хлорамфениколамина была разработана схема твердофазного синтеза, позволяющая получить не только пептидные фрагменты, а полностью синтезировать конъюгаты хлорамфениколамина с С-концевыми фрагментами онкоцина на твердофазном носителе (Рис. 3). Рисунок 3. Схема синтеза пептидных производных хлорамфениколамина на твердофазном носителе (link – -CO(CH2)2CO- или -CO(CH2)3CO-) и защищенного пентапептида. Связывание производных хлорамфениколамина с рибосомами E. coli определяли по вытеснению флуоресцентно-меченого лиганда из его комплексов с бактериальными рибосомами с использованием метода анизотропии флуоресценции. Для каждого из соединений были получены кривые зависимости анизотропии флуоресценции от количества добавленного изучаемого соединения (Рис. 4). По результатам видно, что все полученные соединения вытесняют BODIPY-Ery, что может говорить об их способности связываться в рибосомном туннеле. Рисунок 4. Кривые зависимости анизотропии флуоресценции от концентрации онкоциновых производных хлорамфениколамина, вытесняющих BODIPY-Ery. В результате компьютерного обсчета полученных данных были определены эффективные константы диссоциации комплексов аминокислотных и пептидных производных хлорамфеникола с рибосомой E. coli. Из полученных данных можно сделать вывод, что все производные связываются с бактериальными рибосомами, а константы диссоциации их комплексов находятся в микромолярном диапазоне. Производные с пентандиовым линкером (n=3) связываются с рибосомами сильнее, чем производные с бутандиовым линкером (n=2), а пентапептидные производные сильнее, чем трипептидные производные. Возможно это объясняется тем, что более длинный и гибкий линкер обеспечивает подвижность хлорамфеникольного и пептидного фрагментов в РТ, а дополнительный остаток аргиниа в пентапептиде увеличивает аффинность к рибосоме за счет возможных дополнительных взаимодействий с нуклеотидами РТ. Производное хлорамфениколамина с пентапептидным фрагментом, обратным по направлению относительно исходного онкоцина, соединенным через линкер β-аланин (Ac-PRPRP-β-Ala-CAM) показал наибольшую аффинность к бактериальным рибосомам, превысив таковую у хлорамфеникола в 10 раз. На рисунке 5 приведены результаты моделирования структур аналогов хлорамфеникола, содержащих пентапептидные палиндромные последовательности, в рибосомном туннеле методом молекулярного докинга. Возможно, именно показанными на рисунке контактами определяется высокое сродство этих аналогов к рибосоме. Рисунок 5. Взаимодействие производных хлорамфениколамина, содержащих С-концевые пентапептидные последовательности онкоцина, с рибосомами E.coli по данным молекулярного докинга: САМ-С3-PRPRP (слева), фрагменты рРНК показаны голубым цветом, аналог хлорамфеникола – желтым; Ac-PRPRP-β-Ala-CAM (справа), фрагменты рРНК показаны голубым цветом, аналог хлорамфеникола – фиолетовым. Изучение влияния метилирования рРНК на ингибирующую способность антибиотиков вызывать остановку рибосомы. Метилирование нуклеотидов в рибосомных РНК (рРНК) является общей особенностью, которая встречается во всех живых организмах. Идентификация всех ферментов, ответственных за метилирование рРНК, а также картирование всех модифицированных остатков рРНК теперь завершено для ряда модельных видов, таких как Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. Недавние структуры с высоким разрешением бактериальных рибосом обеспечивали первую прямую визуализацию метилированных нуклеотидов. В последнее время стали доступны структуры рибосом от различных организмов и органелл, что позволяет проводить сравнительный структурный анализ сайтов метилирования рРНК в различных таксономических группах. В 2019 году наш коллектив старался усовершенствовать методику получения рибосомных футпринтов in vitro. Работа шла по двум направлениям. Первое, это усовершенствование системы выделения (увеличение выхода) фрагментов мРНК, защищаемых рибосомами от нуклеазной обработки. Второе, разработка принципиально иной схемы высокопроизводительного анализа мест остановки рибосом in vitro, основанной на методе тоупринтинга - анализе ингибирования удлинения праймера. Метод позволяет определить положение транслирующей рибосомы на мРНК с точностью до нуклеотида, а также используется при изучении механизма действия различных антибиотиков, действие которых направлено на рибосому (Рис. 5). Рисунок 6. Принципиальная схема метода тоупринтинга (слева), определение механизма ингибирующего действия аналогов хлорамфеникола с использованием метода тоупринтинга. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов Внутрисосудистое тромбообразование приводит к развитию серьезных заболеваний: инсульты, инфаркты миокарда, послеоперационные осложнения и др. В настоящее время для лечения используются антикоагулянты - препараты, действующие на свертывающую систему крови и ингибирующие образование фибрина. Центральным белком свертывания крови является тромбин. В настоящее время получены ДНК аптамеры, длиной 30-60 нуклеотидов молекулы, которые ингибируют избыточную активность тромбина. Аптамеры специфически взаимодействуют с белками на пикомолярном уровне. Эти небольшие по размерам молекулы называют «химическими антителами» из-за их высокого сродства к белковой мишени. Аптамеры к тромбину, центральному белку свертывания крови, ингибируют избыточную активность тромбина, как in vitro, так и на животных моделях. Совместно с сотрудниками Кардиоцентра (ФГУ РКНПК Минздрава РФ) проведены доклинические испытания, в которых показано, что тысячекратные дозы аптамеров не токсичны для млекопитающих. С помощью рентгеноструктурного анализа были расшифрованы последовательности нуклеотидов в контактных зонах комплексов тромбин – аптамер RE31, что отвечает на вопрос о механизме «узнавания» между белком и нуклеиновой кислотой. Рисунок 7. Химическая структуры аптамера RE31 (слева). Контактная зона между аптамером RE31 и тромбином по данным рентгеноструктурного анализа (справа): аптамер RE31 приведен в оранжевом цвете, пептидная цепь тромбина - в малиновом цвете, зеленым выделены остатки тимина, которые образуют водородные связи с аминокислотными остатками тромбина (выделены желтым). Атомы азота выделены синим, кислорода - красным, водородные связи даны желтым пунктиром; ион калия, который находится в центре квадруплекса, выделен фиолетовым. Заключение В результате выполнения НИР в 2019 году: 1) С применением методов статического моделирования и молекулярного докинга предложены структуры производных хлорамфениколамина, содержащие фрагменты антимикробного пептида онкоцина. 2) Осуществлен синтез новых пептидных аналогов хлорамфеникола, содержащих С-концевые фрагменты антимикробного пептида онкоцина. 3) С применением метода анизотропии флуоресценции показано, что производные хлорамфениколамина с пентапептидными фрагментами онкоцина связываются с рибосомами E. coli лучше, чем исходный хлорамфеникол, причем пептидный фрагмент, направление цепи которого обратно направлению цепи онкоцина, вносит наибольший вклад в связывание производного. 4) Усовершенствована методика получения рибосомных футпринтов in vitro. а) Усовершенствована система выделения (увеличение выхода) фрагментов мРНК, защищаемых рибосомами от нуклеазной обработки. б) Разработана принципиально новая схема высокопроизводительного анализа мест остановки рибосом in vitro, основанной на методе тоупринтинга. 5) С помощью рентгеноструктурного анализа расшифрованы контакты между остатками нуклеотидов аптамера и аминокислотными остатками тромбина в контактной зоне комплексов тромбин – аптамер RE31. Все запланированные результаты получены. Уровень исследования и полученных результатов сопоставим с мировым. Ранее авторами НИР на основании анализа структурных данных была выдвинута идея синтеза пептидных производных антибиотиков макролидов, в которых пептидная часть имитирует растущую цепь белка, а макролид служит «якорем» для закрепления в специфическом участке РТ. Идея создания таких соединений, представляющих интерес не только как модельные для изучения функционирования рибосомы, но и как вещества, на основе которых могут быть созданы новые антибиотики, является приоритетной: до этого момента подобные соединения в литературе описаны не были. Область исследования рибосомы методом молекулярной динамики возникла совсем недавно, около десяти лет назад, и насчитывает не так много работ. Применяемые в данной НИР подходы: расчетный и экспериментальный, позволяют получать прямые данные о взаимодействии растущей пептидной цепи с “сенсорными” участками рибосомы – важными элементами системы регуляции экспрессии генов на уровне трансляции. Метилирование нуклеотидов в рибосомных РНК (рРНК) является общей особенностью, которая встречается во всех живых организмах. Идентификация всех ферментов, ответственных за метилирование рРНК, а также картирование всех модифицированных остатков рРНК теперь завершено для ряда модельных видов прокариот и эукариот. В дополнение к консервативному ядру модифицированных остатков в рибосомах из большинства изученных организмов структурный анализ указывает на функциональные роли некоторых метилирования рРНК, которые важны в эволюционном контексте. Специфичность и аффинность аптамеров, небольших фрагментов ДНК/РНК, выделенных селекцией,к белковым мишеням высоки и сравнимы со сродством моноклональных антител к этим же белкам. Создание аптамеров к тромбину, центральному белку процесса свертывания крови, является перспективным направлением для их использования в терапии, как основы для создания ингибиторов сосудистого тромбообразования, которое приводит к развитию таких опасных заболеваний, как инфаркт миокарда, ишемический инсульт и т.д.
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов.
Результаты этапа: Реферат Отчет содержит 11 страниц, 5 рисунков. При составлении отчета использовано 42 литературных источника. Объектом исследования данной НИР является взаимодействие нуклеиновых кислот (рРНК, мРНК, ДНК-аптамеров) с пептидами, белками, либо антибиотиками. НИР направлена на получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы и создание терапевтических агентов на основе ДНК-аптамеров. Одним из подходов к реализации этой цели является дизайн, синтез и изучение взаимодействия с рибосомой новых инструментов для исследования механизма регуляции трансляции, полученных на основе антибиотиков, специфически взаимодействующих с рибосомой в области пептидилтрансферазного центра и рибосомного туннеля. Другим подходом к изучению механизмов регуляции трансляции является изучение влияния метилирования рРНК на ингибирующую способность антибиотиков вызывать остановку рибосомы. Еще одним подходом к созданию новых антибактериальных препаратов является поиск новых антибиотиков среди природных образцов. Взаимодействие НК с белками в данной работе исследуется на примере ДНК-аптамеров, высокая специфичность и аффинность которых к белковым мишеням делает их перспективными соединениями для создания терапевтических агентов. При выполнении НИР использованы, как теоретические методы (молекулярная динамика, молекулярный докинг, биоинформатика), так и экспериментальные методы (органический синтез, физико-химические, биохимические). В 2020 году изучено действие новых аналогов десмикозина, содержащих в структуре фрагменты антимикробного пептида онкоцина, на различные штаммы бактерий, в том числе на устойчивые штаммы. С применением методов молекулярной динамики проанализированы структуры этих производных в комплексах с бактериальными рибосомами, найдены структурно-функциональные закономерности. Усовершенствована методика получения рибосомных футпринтов in vitro. Были созданы библиотеки мРНК для высокопроизводительного тоепринтинга, содержащие не менее десяти тысяч вариантов. Данные библиотеки были проанализированы в системе бесклеточной трансляции, выявлены сходные мотивы в последовательностях мРНК, на которых остановка рибосомы антибиотиками происходит наиболее эффективно, а также выявлены мотивы, на которых остановки рибосомы не происходит. На синхротроне Курчатовского Научного Центра получены результаты, на основании которых построена шариковая модель и рассчитана атомарная модель G- квадруплексных структур ДНК аптамеров. Все запланированные результаты получены. Уровень исследования и полученных результатов сопоставим с мировым. Результаты могут найти применение при создании антибактериальных веществ, а также терапевтических агентов класса антикоагулянтов. Основная часть На данном этапе исследования проводились по следующим направлениям: 1) Исследование комплексов бактериальных рибосом молекулярно-динамическими и экспериментальными методами: Моделирование методами молекулярной динамики бактериальной рибосомы в комплексе с синтезированными на предыдущих этапах аналогами рибосомных антибиотиков. Исследование антибактериальной активности аналогов макролидов, содержащих фрагменты антимикробных пептидов. 2) Изучение влияния метилирования рРНК на ингибирующую способность антибиотиков вызывать остановку рибосомы. Анализ библиотек мРНК для высокопроизводительного тоепринтинга. 3) ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов Дизайн и изучение G- квадруплексных структур антипараллельных аптамеров к тромбину совместно с сотрудниками НИЦ "Курчатовский институт" на установке синхротронного излучения. Исследование комплексов бактериальных теоретическими и экспериментальными методами. Антимикробные пептиды онкоцины связываются в рибосомном туннеле бактерий и ингибируют процесс элонгации трансляции. При этом пептид располагается в обратной онтации относительно полипептида, синтезируемого самой рибосомой, – N-конец онкоцина связывается в ПТЦ, а С-конец направлен к выходу из рибосомного туннеля, полностью его блокируя. Область связывания онкоцина перекрывается с сайтом связывания макролидных антибиотиков. Сочетание N-концевых фрагментов онкоцина с макролидным антибиотиком группы тилозина – десмикозином -ведет к получению новых химерных молекул, с помощью которых можно изучать строение РТ и механизмы регуляции трансляции. Подобные соединения, действие которых направлено сразу на несколько сайтов в бактериальной рибосоме, также интересны с точки зрения разработки новых антибактериальных препаратов. Ингибирующая рост бактерий активность ацетилированных тетра-, пента- и гексапептидных производных десмикозина была первоначально оценена в двойной репортерной системе, в которой остановка трансляции белка приводит к экспрессии красного флуоресцентного белка Katushka. Результаты эксперимента показали, что все соединения в разной степени проявляют ингибирующую активность (Рис.1, левая панель), что свидетельствует о том, что ингибирование происходит за счет остановки процесса бактериальной трансляции (в результате их воздействия на клетки экспрессируется красный флуоресцентный белок Katushka). Рисунок 1. Ингибирующая активность ацетилированных пептидных производных десмикозина в двойной репортерной системе pDualrep2 (левая панель): десмикозин (Des), ди- и триацетилированный десмикозин (DesAc2, DesAc3), аналоги десмикозина, содержащие тетра-, пента- и гесапептидные фрагменты онцоцина (DesAc4pep, DesAc5pep, DesAc6pep). Антибактериальная активность аналогов десмикозина на резистентных штаммах E. coli. В продолжение исследования антибактериальной активности аналогов десмикозина синтезированные производные были исследованы на их способность подавлять рост ряда штаммов E. coli, резистных к макролидам, и содержащих мутации в области сайта связывания на рибосоме этих антибиотиков (pAM552, A2059G, A2058G и pErmCL). Аналог, содержащий в структуре тетрапептидный фрагмент онкоцина проявил наиболее выраженное действие, превосходящее действие десмикозина, на штамм, содержащий мутацию A2059G (Рис. 1, правая паннель). Для объяснения проявления аналогами десмикозина такой активности был проведен анализ динамики взаимодействия этих соединений с рибосомой E. coli, а также с мутантной рибосомой, содержащей мутацию A2059G методами молекулярной динамики. Было установлено, что десмикозин наиболее чувствителен к мутации A2059G, в случае такой мутации сильно слабеют водородные связи н.о. с мицинозой, а также с микаминозой антибиотика (Рис. 2). Причина этого заключается в стерическом противоречии N3’-диметиламиногруппы микаминозы с N2-аминогруппой G2059. Рисунок 2. Устойчивые водородные связи десмикозина и десмикозиновой части конъюгатов с нуклеотидными остатками рибосомного туннеля по данным молекулярной динамики В случае пептидных аналогов десмикозина, появление N-домена онкоцина заметно уменьшает чувствительность конъюгата к A2059G сравнительно с десмикозином. Водородные связи мицинозы с н.о. сохраняются в случае заместителя VDKPPY или перераспределяются в случае VDKPPY или KPPY. При этом при образовании комплекса с мутантной рибосомой тетрапептидного аналога десмикозина, содержащего фрагмент KPPY, водородные связи мицинозы с н.о. перераспределяются, но сохраняет водородные связи микаминозы. Основную роль в связывании N-концевого домена онкоцина играет Tyr6, благодаря гидрофобным контактам с каноническим сайтом хлорамфеникола и водородным связям с G2061 (Рис. 3.). Рисунок 3. Наиболее устойчивые водородные связи N-концевой части онкоцина с нуклеотидными остатками рибосомного туннеля по данным молекулярной динамики. Таким образом, можно сделать вывод о том, что тетрапептидный фрагмент онкоцина (KPPY) в конъюгате с десмикозином в меньшей степени склонен к «перетягиванию» десмикозиновой части и, следовательно, к дестабилизации всего комплекса в целом, чем более длинные пептидные фрагменты (Рис. 4). Возможно, именно это и является причиной относительно высокой активности аналога десмикозина, содержащего в структуре N-онцевой тетрапептидный фрагмент онкоцина. Рисунок 4. Наиболее устойчивые водородные связи онкоцинового фрагмента конъюгата с десмикозином с нуклеотидными остатками рибосомного туннеля по данным молекулярной динамики. Изучение влияния метилирования рРНК на ингибирующую способность антибиотиков вызывать остановку рибосомы. Метилирование нуклеотидов в рибосомных РНК (рРНК) является общей особенностью, которая встречается во всех живых организмах. Идентификация всех ферментов, ответственных за метилирование рРНК, а также картирование всех модифицированных остатков рРНК теперь завершено для ряда модельных видов, таких как Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. Недавние структуры с высоким разрешением бактериальных рибосом обеспечивали первую прямую визуализацию метилированных нуклеотидов. В последнее время стали доступны структуры рибосом от различных организмов и органелл, что позволяет проводить сравнительный структурный анализ сайтов метилирования рРНК в различных таксономических группах. В 2020 наш коллектив работал над усовершенствованием методики получения рибосомных футпринтов in vitro. Метод позволяет определить положение транслирующей рибосомы на мРНК с точностью до нуклеотида, а также используется при изучении механизма действия различных антибиотиков, действие которых направлено на рибосому. Были созданы библиотеки мРНК для высокопроизводительного тоепринтинга, содержащие не менее десяти тысяч вариантов. Данные библиотеки были проанализированы в системе бесклеточной трансляции, выявлены сходные мотивы в последовательностях мРНК, на которых остановка рибосомы антибиотиками происходит наиболее эффективно, а также выявлены мотивы, на которых остановки рибосомы не происходит. Большая часть остановленных рибосом содержит в А-сайте стоп кодон, что подтверждает адекватность данной системы. Кроме того, обнаружена остановка трансляции на кодонах AGT, AAT и CTA. Рисунок 5. Анализ библиотек мРНК для высокопроизводительного тоепринтинга: эффективность остановки трансляции на разных кодонах. ДНК аптамеры - как перспективный класс терапевтических агентов Внутрисосудистое тромбообразование приводит к развитию серьезных заболеваний: инсульты, инфаркты миокарда, послеоперационные осложнения и др. В настоящее время для лечения используются антикоагулянты - препараты, действующие на свертывающую систему крови и ингибирующие образование фибрина. Центральным белком свертывания крови является тромбин. В настоящее время получены ДНК аптамеры, длиной 30-60 нуклеотидов молекулы, которые ингибируют избыточную активность тромбина. Аптамеры специфически взаимодействуют с белками на пикомолярном уровне. Эти небольшие по размерам молекулы называют «химическими антителами» из-за их высокого сродства к белковой мишени. Аптамеры к тромбину, центральному белку свертывания крови, ингибируют избыточную активность тромбина, как in vitro, так и на животных моделях. Совместно с сотрудниками Кардиоцентра (ФГУ РКНПК Минздрава РФ) проведены доклинические испытания, в которых показано, что тысячекратные дозы аптамеров не токсичны для млекопитающих. Изучение G- квадруплексных структур ДНК аптамеров актуально, т.к. эти структуры могут претендовать на роль терапевтических препаратов при лечении, как внутрисосудистых тромбозов, так и при онкологических заболеваниях. Именно поэтому исследование структур этих молекул как в свободном виде, так и в комплексах с белками представляет большой интерес. В эксперименте, проведенном на синхротроне Курчатовского Научного Центра, получены результаты, которые позволили построить шариковую модель, а затем с помощью программ Chemcraft и Avagadro рассчитать атомарную модель данных аптамеров. Заключение В результате выполнения НИР в 2020 году: 1) Исследована способность аналогов десмикозина, содержащих в структуре фрагменты антимикробного пептида онкоцина, подавлять рост различных штаммов бактерий, в том числе, устойчивых к антибиотикам штаммов. С применением методов молекулярной динамики проанализированы структуры аналогов десмикозина, содержащих фрагменты онкоцина, в комплексе с бактериальной рибосомой. Найдены структурно-функциональные закономерности. 2) Усовершенствована методика получения рибосомных футпринтов in vitro. Библиотеки мРНК для высокопроизводительного тоепринтинга проанализированы в системе бесклеточной трансляции, выявлены сходные мотивы в последовательностях мРНК, на которых остановка рибосомы антибиотиками происходит наиболее эффективно, а также выявлены мотивы, на которых остановки рибосомы не происходит 3) На синхротроне Курчатовского Научного Центра получены результаты, на основании которых построена шариковая модель и рассчитана атомарная модель G- квадруплексных структур ДНК аптамеров. Все запланированные результаты получены. Уровень исследования и полученных результатов сопоставим с мировым. Ранее авторами НИР на основании анализа структурных данных была выдвинута идея синтеза пептидных производных антибиотиков макролидов, в которых пептидная часть имитирует растущую цепь белка, а макролид служит «якорем» для закрепления в специфическом участке РТ. Идея создания таких соединений, представляющих интерес не только как модельные для изучения функционирования рибосомы, но и как вещества, на основе которых могут быть созданы новые антибиотики, является приоритетной: до этого момента подобные соединения в литературе описаны не были. Область исследования рибосомы методом молекулярной динамики возникла совсем недавно, около десяти лет назад, и насчитывает не так много работ. Применяемые в данной НИР подходы: расчетный и экспериментальный, позволяют получать прямые данные о взаимодействии растущей пептидной цепи с “сенсорными” участками рибосомы – важными элементами системы регуляции экспрессии генов на уровне трансляции. Существуют различные методики получения рибосомных футпринтов. В нашей работе созданы библиотеки мРНК для высокопроизводительного тоепринтинга и проанализированы в системе бесклеточной трансляции, выявлены сходные мотивы в последовательностях мРНК, на которых остановка рибосомы антибиотиками происходит наиболее эффективно, а также выявлены мотивы, на которых остановки рибосомы не происходит. В дальнейшем это позволит создать универсальную РНК-матрицу для анализа процесса трансляции и изучения механизмов действия антибиотиков, воздействующих на процесс трансляции. К настоящему времени в литературе такие системы не описаны. Специфичность и аффинность аптамеров, небольших фрагментов ДНК/РНК, выделенных селекцией, к белковым мишеням высоки и сравнимы со сродством моноклональных антител к этим же белкам. Изучение G- квадруплексных структур ДНК аптамеров актуально, т.к. эти структуры могут претендовать на роль терапевтических препаратов при лечении, как внутрисосудистых тромбозов, так и при онкологических заболеваниях. Именно поэтому исследование структур этих молекул как в свободном виде, так и в комплексах с белками перспективно.
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы
Результаты этапа:
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Дизайн и получение антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы


Имя Описание Имя файла Размер Добавлен