Фототаксис микроорганизмовНИР

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
14 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Фототаксис микроорганизмов
Результаты этапа: Ранее путем исследования генетических трансформантов с повышенным содержанием одного из каналородопсинов мы показали, что каналородопсин 1 (КР1) модельного организма C. reinhardtii отвечает преимущественно за генерацию быстрого трансмембранного фототока с высоким уровнем светового насыщения, а каналородопсин 2 (КР2) - медленного, с низким насыщением, который отражает активацию вторичных кальциевых каналов в плазмалемме. Однако оставалось неясным, полностью ли разделены эти фунцкии, или они частично пересекаются. Недавно в другой лаборатории методом инсерционного мутагенеза был получен штамм-нокаут (нулевой мутант) КР1-гена, что дало нам возможность провести анализ фотоиндуцированных токов, генерируемых КР2, в отсутствие какого бы то ни было вклада со стороны КР1. В отчетном году мы провели сравнительный анализ экспрессии генов у нокаута (нулевого мутанта) по КР1 хламидомонады и ее дикого типа методом РНК-секвенирования (RNA-Seq). Полученные данные подтвердили, что штамм-нокаут практически не содержит КР1-мРНК, соответствующей участку гена ниже сайта вставки. Однако содержание мРНК гипотетических кальциевых каналов в клетках оказалось слишком низким для того, чтобы можно было идентифицировать гены тех из них, транскрипция которых могла бы быть нарушена у нокаута по сравнению с диким типом. Наше исследование спектральной зависимости быстрого компонента тока у нокаута в отчетном году, показало, что он также генерируется КР2, как и замедленный компонент. Более того, эксперименты по удалению ионов кальция из среды выявили, что у КР2 фунцкия прамой канальной активности конкурирует с фунцкией активации вторичных кальциевых каналов: когда концентрация в среде Ca2+ снижается, КР2 уже не может эффективно активировать воричные каналы, и его активность становится более похожей на ту, какую он проявляет в модельных клетках животных. Для исследования фунцкии КР1 в отсутствие соответствующего нокаута мы использовали возбуждение дикого типа длинноволновым светом, который КР2 практически не поглощает. Световая кривая, измеренная в таких условиях, не содержит компоненты насыщения при низких интенсивностях, что указывает на то, что этот компонент генерируется исключительно КР2. Хотя удаление из среды Ca2+ также приводит к снижению амплитуды токов, опосредованных КР1, дифференциальные сигналы, полученные вычитанием сигналов при низком Ca2+ из сигналов при высоком, не имеют лаг-периода, в отличие от сигналов, измеренных на КР1-нокауте. Таким образом, можно сделать заключение, что КР1 не участвует в активации вторичных каналов у водорослей, или, по крайней мере, степень его участия намного меньше, чем у КР2. В процессе исследования механизмов внутримолекулярного переноса протонов мы обнаружили, что у некоторых низкоэффективных каналородопсинов мутации, нейтрализующие отрицательный заряд карбоксильных групп аминокислотных остатков, образующих комплексный противоион Шиффова основания (гомологов Асп-85 и Асп-212 бактериородопсина), вызывают не длинноволновый спектральный сдвиг, как у большинства ранее исследованных ретинальных белков, а коротковолновый. Эти низкоэффективные каналородопсины не содержат остатка лизина во второй трансмембранной спирали, имеющегося у высокоэффективных каналородопсинов и соответствующего Лиз-132 химерного каналородопсина, кристаллическая структура которого была разрешена. Путем измерения спектров действия фотоиндуцированных канальных токов в культуре модельных клеток HEK293 и абсорбционной спектроскопии выделенных пигментов мы показали, что у исследованных каналородопсинов гомолог Лиз-132 контролирует направление спектрального сдвига, вызываемого мутациами карбоксильных остатков активного центра. Анализ двойных мутантов каналородопсинов показал, что наличие этого лизина у пигмента дикого типа или его добавление в результате мутагенеза приводит к длинноволновому спектральному сдвигу, а замещение его нейтральным остатком приводит к сдвигу в коротковолновую область. Нейтрализация самого этого остатка у высокоэффективных каналородопсинов также вызывает длинноволновый сдвиг, а его добавление в структуру низкоэффективного каналородопсина из водоросли Chlamydomonas augustae (CaChR1) вызывает коротковолновый сдвиг. Принимая во внимание то, что эффективный заряд карбоксильных групп аминокислот - ключевой фактор регуляции спектральных свойств родопсинов, эти результаты свидетельствуют, что гомолог Лиз-132 модулирует pKa этих групп. С другой стороны, мы установили, что мутации гомолога Арг-82, который играет эту роль в молекуле бактериородопсина, практически не влияют на спектральные свойства исследованных каналородопсинов. Титрование показало, что pKa гомолога Асп-85 у CaChR1 находится в щелочной области, в отличие от большинства ранее изученных родопсинов, но существенно снижается после добавления гомолога Лиз-132 или нейтрализации гомолога Асп-212. Кроме того, мы обнаружили, что у всех исследованных каналородопсинов гомолог Лиз-132 регулирует кинетику открывания и закрывания канала. Фотоактивация аттрактантного рецептора при фототаксисе Halobacterium salinarum, сенсорного родопсина I (SRI), предполагает перенос протона от Шиффова основания на акцептор в цитоплазматическом полуканале. На основании исследований переноса протона и двигательных реакций клеток в качестве кандидата на эту роль был предложен остаток Хис-166, однако прямые доказательства отсутствовали. В отчетном году мы подтвердили, при помощи дифференциальной инфракрасной Фурье-спектроскопии в комбинации с мутагенезом и изотопным замещением, что этот остаток действительно является акцептором протона Шиффова основания в фотоцикле, претерпеваемом SRI в комплексе с его трансдьюсером. В недавнем проекте по секвенированию транскриптомов водорослей, выполненном генетическим консорциумом, было идентифицировано несколько десятков новых последовательностей каналородопсинов. Интересно, что у некоторых видов водорослей было обнаружено две или даже три таких последовательности на геном. Как было показано ранее нами и другими исследователями, два каналородопсина модельного организма Chlamydomonas reinhardtii проявляют разные свойства как в нативных клетках, так и при гетерологической экспрессии в культуре клеток животных. В отчетном году мы начали сравнительный анализ канальной фунцкии еще четырех пар каналородопсинов, идентифицированных в геномах четырех видов водорослей, в модельной системе (культуре клеток НЕК293) и показали, что такие свойства, как более быстрая кинетика тока и зависимость максимума поглощения от рН, отличающие КР1 от КР2 у водоросли C. reinhardtii, не характерны для других пар каналородопсинов, выделенных из одного и того же организма. В процессе этой работы также выяснилось, что одна из опубликованных последовательностей каналородопсинов водоросли Platymonas subcordiformis, считавшаяся нефункциональной, содержала ошибку, устранение которой путем клонирования соответствующей кДНК позволило нам исследовать генерируемые ею фототоки.
15 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Фототаксис микроорганизмов
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".