| Результаты этапа: В ходе выполнения работ в 2014 году были сконструированы праймеры и с их помощью методом ПЦР получены фрагменты генома ротавируса человека группы А (генотип G4P[8]), кодирующие протективные белки VP4 и VP7. Далее были получены плазмидные векторы для биосинтеза в клетках эукариот белков VP4 и VP7 как по отдельности, так и в паре с инсулиновым сигнальным пептидом. Полученные плазмидные векторы были охарактеризованы секвенированием, накоплены в необходимом количестве и очищены. Полученными плазмидами была трансфецирована культура клеток СHO для выявления экспрессии генов ротавирусных белков в экспериментах in vitro. Уровень экспрессии, а также локализацию белка в культуре клеток оценивали при помощи метода непрямой иммунофлуоресценции с использованием иммунных человеческих сывороток. Этой работе предшествовал отдельный этап по разработке лабораторной ИФА-тест-системы для характеристики сывороток. Такая тест-система была создана с использованием антигена ротавируса, выделенного из фекального образца от больного с подтвержденной ротавирусной инфекцией, а также отдельных компонентов коммерческой тест-системы для выявления ротавирусного антигена. По количеству светящихся клеток и интенсивности их свечения было установлено, что в варианте трансфекции, конструкциями без сигнального пептида происходило накопление антигена внутри клетки, тогда как при трансфекции клеток плазмидными векторами с сигнальным пептидом внутриклеточное накопление антигена происходило в меньшей степени.
Полученными плазмидными конструкциями иммунизировали мышей с целью оценить их иммуногенность. Для решения этой задачи была создана лабораторная ИФА-тест-система для выявления мышиных IgG к ротавирусу группы А. В качестве источника ротавирусного антигена использовали культуру клеток Vero, заражённую лабораторным штаммом ротавируса группы А. В сыворотках крови животных был выявлен прирост уровня антиротавирусных IgG антител у мышей, иммунизированных конструкциями с генами протективных белков ротавирусов, при этом не было выявлено прироста антител у мышей, иммунизированных контрольной плазмидой без вставки. Наблюдалось также значительное превышение титров противоротавирусных антител при иммунизации плазмидами с инсулиновым пептидом, вероятно за счет повышения секреции антигена во внеклеточное пространство. Достоверность полученных различий требует подтверждения в повторных опытах на большем количестве животных.
Наряду с работой по созданию лабораторных тест-систем для оценки поствакцинального иммунитета у человека и животных, инициирована работа по получению моноклональных антител к протективным антигенам ротавирусов, которые будут использованы для проведения контрольных тестов при выполнении следующих этапов исследования.
Синтезированы водорастворимые производные хитозана путем алкилирования аминогрупп глицидилтриметиламмоний хлоридом. Показано, что полученные полимеры взаимодействуют с ДНК не только в бессолевых растворах, но при физиологической концентрации соли. Синтезированы линейный и ряд сетчатых полимеров N,N-диметиламиноэтилметакрилата (ПДМАЭМА). Изучено их взаимодействие с ДНК и выявлены закономерности образования и диссоциации полученных комплексов. Изучено взаимодействие линейного полиэтиленимина с фотосенсибилизатором хлорином е6. Показано, что связывание имеет не только электростатическую природу, но дополнительно стабилизируется другими типами взаимодействий, предположительно – гидрофобными и водородными связями. Проведено сравнительное изучение цитотоксичности поликатионов разной природы по отношению к клеткам в культуре. Показано, что наименьшей цитотксичностью характеризуются препараты хитозана. Обнаружено, что цитотоксичность линейного полиэтиленимина зависит от его молекулярной массы. Исследована возможность получения возбужденного состояния фотосенсибилизатора хлорина е6 за счет энергии химической реакции. Известно, что очаги воспаления содержат повышенные количества перекиси водорода. Эту биохимическую особенность можно было бы использовать для локальной доставки нуклеиновых кислот методом фотосенсибилизированной интернализации, причем в этом случае источником энергии для возбуждения фотосенсибилизатора может служить не внешний источник света, а перекись водорода. Разработана система проведения пероксиоксалатной хемилюминесцентной реакции в водной среде.
Проведена серия экспериментов по фотохимической активации трансфекции культуры клеток яичников китайских хомячков СНО репортерным геном светляковой люциферазы (плазмида pCMV-luc) в комплексе с препаратами линейного полиэтиленимина (MW 2,5 и 25 кД). Была оптимизирована концентрация фотосенсибилизатора, режим его добавления и доза облучения. Для первых опытов по фотохимической активации трансфекции выбрали режим облучения 20 мВт/см2 в течение 15 секунд и концентрацию хлорина е6 0,5 мкМ, обеспечивающий не менее чем 95%-ю выживаемость клеток. Далее в опытах по трансфекции культуры клеток определено влияние облучения клеток в присутствии хлорина е6 и комплексов ПЭИ/ДНК на эффективность трансфекции. Пилотные эксперименты показали примерно 3-х кратный прирост эффективности трансфекции клеток CHO комплексами ПЭИ (2,5 кД)/ДНК (N/P=10) в присутствии хлорина е6 с облучением лазером, по сравнению с необлученными клетками (p≤0.01). Варьированием дозы облучения, концентрации фотосенсибилизатора, типа носителя ДНК и других параметров на следующих этапах работы будут подобраны условия для более эффективной фотохимической активации трансфекции, что позволит перейти к изучению эффективности метода в экспериментах in vivo.
По результатам проведенных работ подготовлена научная статья, которая будет опубликована в журнале Высокомолекулярные соединения. |
| Результаты этапа: 1. Получение генноинженерным путем конструкций для биосинтеза белков VP6 и VP4 в прокариотической системе экспрессии.
Были получены генетические конструкции для синтеза белка ∆VP8*[P8] (генотип G4P[8]), в прокариатической и эукариотической системах экспрессии. Рекомбинатный белок в бактериях был получен для того чтобы использовать его в системе ИФА для анализа иммунизированных ДНК или РНК-вакцинами мышей на наличие протективных антител в сыворотках крови (при этом антиген будет сорбирован на планшеты для ИФА), а также для получения гипериммунных сывороток, которые в дальнейшем можно будет использовать для детекции методом непрямого ИФА антигенов, синтезированных в экспериментах in vitro и in vivo при трансфекции клеток млекопитающих комплексами с РНК и ДНК вакцинами.
На рисунках 1а и 2а представлены схемы полученных ДНК-конструкций, а на рисунке 1б – плазмида pCI-neo-∆VP8*[P8], выделенная в препаративных количествах методом щелочного лизиса, и ее контрольная рестрикция, подтверждающая наличие вставки необходимого размера. Следует отметить, что при выделении из 1 литра культуральной жидкости выход плазмиды pCI-neo-∆VP8*[P8] составил 2820 мкг препарата, при этом чистота по белкам и неорганическим загрязнителям не выходила за пределы нормы и составила 1.7 и 2.4, соответственно. Не было необходимости выращивать плазмиду pQE30 -∆VP8*[P8] в больших количествах, т.к. она использовалась только для трансформации в клетки М15. Она выделялась методом кипячения, ее контрольная рестрикция представлена на рисунке 2б.
После трансформации pQE30 -∆VP8*[P8] в клетки М15, была проведена индукция синтеза белка в бактериальных клетках. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 2. Получение рекомбинатных антигенов ротавируса в клетках E. сoli и очистка полученного белка, либо наработка и очистка вируса, полученного в чувствительной культуре клеток.
Были получены высопродуктивные штаммы бактерий, была изучена растворимость полученного белка ∆VP8*[P8], а также в реакции иммуноблотинга с гипериммунными сыворотками была подтверждена его специфичность (рис. 4 а, б). Белок оказался плохорастворимым, и был выделен в виде телец включений. Для решения проблемы растворимости белка было проведено несколько экспериментов, например, бактерии выращивались при пониженной температуре (18ºС), была осуществлена попытка провести так называемый in vitro рефолдинг (с отмывкой бактерий от IPTG и добавлением антибиотика хлорамфеникола для остановки размножения бактерий). Но эти попытки не привели к желаемому результату. Поэтому тельца включения растворяли в 8М растворе мочевины (pH 8) и проводили хроматографическую очистку белка в денатурирующих условиях с использованием никель-агарозы. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 5. После этого проводили рефолдинг белка посредством диализа. При этом для диализа также подбирались условия, при которых белок не выпадал в осадок (эмпирическим путем подбирали состав диализного буфера и значение его рН). Концентрация растворимой формы белка составила 450 мкг/мл (общее количество – около 1 мг). Затем, этот белок был тестирован в ИФА. В результате было отмечено, что белок ∆VP8*[P8] реагирует с антителами в сыворотках иммунизированных мышей, полученных на предыдущих этапах проекта (рисунок 6) по сравнению с неиммунными. При этом, были получены высокие фоновые значения с контрольной сывороткой, которые связаны, скорее всего, с несовершенством имеющейся тест-системы. Кроме того, белок был использован для иммунизации мышей с целью получения гипериммунных сывороток.
3. Разработка экспериментальных тест-систем на основе иммуноферментного анализа для оценки иммунного ответа у мышей на введение кандидатных ДНК-вакцин.
Были проанализированы сыворотки животных, иммунизированных генетическими конструкциями, кодирующими ОРС белка VP7 ротавирусов (как отдельно, так и в паре с инсулиновым сигнальным пептидом). Результаты этой серии экспериментов представлены на рисунке 11. Статистический анализ полученных данных позволил сделать вывод о достоверном приросте титров IgG антител к ротавирусному антигену в сыворотках крови мышей, проиммунизированных конструкциями pVP7 и pVP7ins, по сравнению с животными, обработанными контрольной плазмидой pTriEx-4 Neo. Таким образом, можно утверждать, что созданные нами генно-инженерные конструкции pVP7 и pVP7ins способны вызывать гуморальный иммунный ответ с достаточно высокой концентрацией IgG антител к белку VP7.
Результаты повторной иммунизации мышей конструкциями, кодирующими ОРС белка VP7 и VP7ins, (трехкратной, с применением электропорации) представлены на рисунке 12. В этой серии экспериментов мы наблюдали прирост IgG антител к белку VP7 у мышей, обработанных плазмидами, кодирующими этот белок. При этом обработка электропоратором не вызвала прироста титров антител. Возможно, это связано с неоптимальными условиями электропорации.
4. Получение генноинженерных конструкций для синтеза мРНК, кодирующей протективный белок ротавирусов (модель РНК-вакцины), в условиях in vitro. Оценка накопления белка VP7 в культуре клеток, трансфецированной соответствующей синтетической мРНК.
На этом этапе проекта была запланировано получение мРНК, кодирующей синтез иммуногенного белка ротавирусов, как перспективного препарата для РНК-иммунизации. Для этого использовали генетическую конструкцию pCI-neo-∆VP8*[P8]. Схема получения транскриптов представлена на рисунке 7. В результате были получены и охарактеризованы РНК-транскрипты, кодирующие белок ∆VP8*[P8] ротавирусов. Электрофорез транскриптов (опытного и контрольного) представлена на рисунке 8.
Во всех упомянутых в отчете ИФА тестах и иммуноблотинге (для выявления антигена) использовали сыворотки мышей, проиммунизированных ротавирусом штамм 568 и неиммунных мышей. Результаты первичного титрования полученных сывороток представлены на рисунке 10. Эти результаты были получены в 2014 году. Титр специфических ротавирусных IgG антител в гипериммунных сыворотках составил 1:6400.
5. Наработка и очистка препаратов иммуногенных ДНК и РНК для экспериментов in vivo.
Препараты мРНК были наработаны в количестве 500 нг/мкл (всего 25 мкг). Кроме того, были отработаны условия трансфекции культуры клеток CHO, с использованием коммерческого препарата для трансфекции Lipofectamine 2000 и контрольного препарата мРНК, кодирующего ген светляковой люциферазы. Результаты этой серии экспериментов представлены на рисунке 9. Было показано, что максимальная люциферазная активность наблюдается в клетках, обработанных комплексами, содержащими 2мкг мРНК. Дальнейшее увеличение количества мРНК не ведет к нарастанию сигнала люминесценции.
6. Изучение взаимодействия фотосенсибилизатора хлорина е6 с полимерными носителями различной природы.
6.1. Солюбилизация хлорина е6 и его додекафторгептиловых эфиров в мицеллах блок-сополимера ПЭГ-гексафторбутилметакрилат (ПЭГ114-6ФБМА17).
ПЭГ150-ПГФБМА17 является амфифильным полимером, содержащим гидрофобный блок. Поэтому этот полимер в водном растворе образует мицеллы. Нашей целью было установить, взаимодействует ли данный фторированный полимер с хлорином е6 и его фторсодержащим аналогом.
6.1.1. Взаимодействие блок-сополимера ПЭГ114-6ФБМА17 с хлорином е6
Взаимодействие хлорина с мицеллами полимера было исследовано с помощью УФ-спектроскопии (рис. 13а) .
Мы предположили, что поглощение хлорина на этом плато соответствует полному встраиванию хлорина в мицеллы. Это означает, что хлорин е6 связывается со фторированным амфифильным полимером, а значит, возможно рассчитать коэффициент распределения хлорина между мицеллами полимера и водой. Коэффициент распределения, определенный из этих экспериментов, составил 1428±120. Эта величина гораздо меньше, чем при связывании хлорина с плюроником F127. Можно предположить, что фтор-содержащие системы являются плохими растворителями для нефторированных соединений.
6.1.2. Ди-додекафторгептиловый эфир хлорина е6 (FCe6).
Для изучения взаимодействия ди-додекафторгептилового эфира хлорина е6 с мицеллами фторированного полимера был проведён аналогичный опыт. Однако, в данном случае оптическая плотность раствора при длине волны и 668 нм закономерно увеличивается с ростом концентрации полимера, а сдвиг максимума вблизи 660 нм направлен в коротковолновую область спектра (Рис. 14а). При этом оптическая плотность раствора при длине волны 668 нм закономерно увеличивается с ростом концентрации полимера и при высоких концентрациях полимера выходит на плато (Рис 14б).
Оказалось, что FCe6 связывался с фторированным полимером в 5 раз лучше, чем Ce6. Это согласуется с известными представлениями о высоком сродстве фторированных веществ друг к другу.
Исследование взаимодействия синтезированного полимера ПЭГ1146ФБМА17 с клетками в культуре показало, что он практически не проявляет цитотоксичность вплоть до концентрации 10 мг/мл. Это означает, что данный полимер может быть перспективным носителем для хлорина е6 в экспреиментах по фотохимической интернализации.
6.2. Взаимодействие хлорина е6 с хитозаном, модифицированным глицидил-триметиламмонийхлоридом (ГТМАХ).
Ранее мы показали, что хитозан эффективно связывается с хлорином е6 в кислой среде, однако при повышении рН до нейтральных значений связывание полимера с хлорином е6 значительно уменьшается. Поэтому можно было ожидать, что хитозан, модифицированный глицидил-триметиламмоний хлоридом , а значит содержащий четвертичные аммонийные группы, будет эффективно взаимодействовать с хлорином е6 в нейтральной среде.
Оказалось, что в бессолевой среде при рН 7.4 добавление к хлорину е6 хитозана, модифицированного ГТМАХ на 90% приводило к значительному снижению коэффициента экстинкции полосы поглощения порфирина при длине волны 668 нм. Полное связывание достигалось при стехиометрическом соотношении заряженных групп. Однако при физиологической концентрации соли эффективность взаимодействия резко снижалась. Связывание более 50% хлорина с полимером наблюдалось лишь при 50-100-кратном молярном избытке полимерного носителя. Учитывая высокую цитотоксичность катионизованного хитозана, данный полимер представляется мало пригодным для фотохимической интернализации.
7. Исследование эффективности фотохимической интернализации с применением различных поликатионных носителей.
На первом этапе было исследовано влияние сетчатых поликатионов на основе ПДМАЭМА и линейного ПЭИ 2.5 кДа на трансфекцию клеток СНО в культуре клеток. Было показано, что сетчатые полимеры на основе ПДМАЭМА способны доставлять в клетки малую интерферирующую РНК (рис. 15а), однако эффективность этих сополимеров по отношению к плазмидной ДНК оказалась невелика (рис. 15б). Данные результаты были опубликованы в журнале Colloids and Surfaces B: Biointerfaces.
Значительно более высокая эффективность трансфекции наблюдалась для линейного ПЭИ с молекулярной массой 2.5 кДа. Оказалось, что она лишь в 1.5 раза ниже, чем эффективность липофектами, являющегося стандартным трансфецирующим агентом. Еще более высокую эффективность трансфекции удалось обнаружить при использовании полиэтиленимина 2.5 кДа, сшитого дисульфидными связями с помощью дитио-бис-пропионимидата (ДТБП). Данный препарат обнаруживал эффективность трансфекции близкую к липофектамину (Рисунок 16), однако обладал меньшей цитотоксичностью. Поэтому сшитый полиэтиленимин можно рассматривать как перспективный носитель для получения вакцин.
Для оптимизации условий фотохимической интернализации были получены комплексы ДНК, содержащей маркерные гены, с линейным ПЭИ 2.5 кДа, 25 кДа и ПЭИ 2.5 кДа, сшитым с помощью ДТБП. При фиксированном составе комплекса ([N]/[P]=30) было проварьировано содержание фотосенсибилизатора от 1 до 10 мкМ в смеси. Клетки инкубировали с комплексами и фотосенсибилизатором в присутствии фетальной сыворотки в течение 1 часа, после чего образцы облучали лазером с длиной волны 658 нм при дозе облучения 5, 10 и 20 Дж/см2. Оказалось, что при малых дозах облучения 5 и 10 Дж/см2 добавление фотосенсибилизатора повышает эффективность трансфекции лишь незначительно (в 1.2-1.5 раз), а при повышении дозы облучения до 20 Дж/см2 проявляется эффект фототоксичности фотосенсибилизатора. Можно предположить, что низкая эффективность хлорина в комбинации с полимерами на основе ПЭИ вызвана тем, что данный полимеро проявляет лишь очень незначительное сродство к данному фотосенсибилизатору. Поэтому, после захвата в клеточные эндосомы, комплекс ДНК-поликатион с одной стороны и фотосенсибилизатор, с другой стороны, находятся в различных эндосомальных везикулах, а значит фотодинамический эффект лишь вызывает токсическое действие, не влияя на проникновение нуклеиновой кислоты.
На следующем этапе работы будут предприняты попытки увеличить эффективность трансфекции за счет включенгия в состав конструкций амфифильных полимеров, эффективно связывающих хлорин е6 или его фторированное производное.
8.Химическая модификация полимерных носителей для оптимизации их трансфекционной способности.
8.1. Синтез длинноцепочечного полиэтиленимина, содержащего биодеградируемые дисульфидные связи.
Полиэтиленимин (ПЭИ) является одним из наиболее эффективных трансфецирующих агентов, поэтому целесообразно использовать его для фотохимической интернализации. Однако этот полимер проявляет высокую токсичность как в экспериментах на культурах клеток, так и in vivo. Известно, что цитотоксичность разветвленного ПЭИ сильно зависит от его молекулярной массы [ ]. Однако известно, что длинноцепочечный ПЭИ лучше связывается с нуклеиновыми кислотами и проявляет более высокую трансфекционную активность. Кроме того, как следует из отчета за предыдущий год, длинноцепочечный ПЭИ более эффективно взаимодействует с хлорином е6.
Мы предположили, что объединение нескольких молекул короткоцепочечного в одну более высокомолекулярную макромолекулу через дисульфидные мостики позволит увеличить его трансфекционную активность. При этом можно ожидать, что расщепление дисульфидных связей в клетке под действием глутатиона будет приводить к значительному снижению токсических эффектов как in vitro, так и in vivo.
Для корректного анализа продуктов, полученных в процессе такого сшивания, требуется определять их молекулярную массу. Как правило, для определения молекулярной массы линейного полиэтиленимина в литературе используется гельпроникающая хроматография с детектором многоуглового светорассеяния. Данный метод для нас был недоступен, поэтому для анализа молекулярных масс ПЭИ в работе был использован подход, основанный на расчете среднечисловых молекулярных масс полимера по количеству концевых функциональных групп.
На первом этапе данный подход был опробирован на коммерчески доступных препаратах полиэтиленимина, имеющем молекулярную массу 2.5 кДа. Для этого содержание концевых аминогрупп в растворе этого полимера было определено с помощью реакции с тринитробензол сульфокислотой [ ] (рис. 17а). Известно, что скорость реакции ТНБС с первичными аминогруппами на 3 порядка превышает скорость его реакции со вторичными аминами, поэтому быстрые изменения оптической плотности, происходящие в первые минуты после смешивания реагентов, обычно относят к реакции с первичными аинами, а последующий медленный линейный рост – к гидролизу ТНБС до пикрата и ее реакции со вторичными аминами. Для количественного измерения оптической плотности, отвечающей реакции ТНБС с концевыми группами ПЭИ, мы проводили экстраполяцию кинетической кривой к нулевому времени (Рисунок 17б).
Для определения массовой концентрации ПЭИ в хроматографических фракциях использовалась реакция комплексообразования поликатиона с сульфо-содержащим хромофором Кумасси G-250 (рис. 19а). Связывание красителя с полиэтиленимином сопровождается батохромным сдвигом в спектре красителя, причем повышение концентрации ПЭИ в интервале от 0.01 до 0.1 мг/мл приводит к линейному росту поглощения красителя на длине волны 550 нм. Калибровочные кривые, полученные для коммерчески доступных препаратов с молекулярной массой 2.5 кДа и 25 кДа практически совпадают, что указывает на то, что связывание красителя с ПЭИ в кислой среде практически не зависит от молекулярной массы поликатиона. Это позволяет измерять концентрацию ПЭИ в постколоночных фракциях по калибровочной кривой, показанной на рисунке 19б. Как было показано выше, соотношение массовой концентрации полиэтиленимина и концентрации концевых аминогрупп позволяет рассчитать среднечисловую молекулярную массу полимера. На основании измерения этих двух параметров во фракциях, полученных при хроматографии коммерческого преарата ПЭИ 25 кДа, была построена калибровочная кривая, связывающая объем элюции данной фракции с ее среднечисловой молекулярной массой, определенной независимо как соотношение массовой концентрации ПЭИ и молярной концентрации концевых групп. (рис. 2б). В дальнейшем эта калибровочная зависимость была использована для определения молекулярной массы сшитого ПЭИ, содержащего дисульфидные связи.
Полиэтиленимин, содержащий биодеградируемые дисульфидные связи согласно ранее предложенному методу [ ]. Однако, в отличие от упомянутой публикации, в настоящем исследовании был проведен синтез линейного полиэтиленимина, содержащего дисульфидные связи в основной цепи.
Для этого линейный ПЭИ с молекулярной массой 2.5 кДа сшивали с помощью диметил -3,3’-дитиобиспропионимидата (ДТБП), после чего фракционирвоали с помощью гель-проникающей хроматографии на сефадексе G-50, используя в качестве элюента 10 мМ цитрат натрия с добавкой 0.5 М NaCl, рН 3.3 (рис. 21а).
Как видно из данных, показанных на рисунке 21б, в результате реакции с ДТБП около 10% неизрасходовавшегося полиэтиленимина 2.5 кДа остается в реакционной смеси. При этом основная фракция имеет среднечисловую молекулярную массу около 10 кДа, что соответствует соединению 4 молекул исходного ПЭИ 2.5 кДа. В препарате также содержатся фракции с более высокой молекулярной массой (20-40 кДа) , но их содержание невелико.
Полученный сшитый ПЭИ был в дальнейшем использован для исследования трансфекции и фотохимической интернализации in vitro.
8.2. Синтез амфифильных блок-сополимеров, содержащих фторированный гидрофобный блок.
Фотодинамический эффект, используемый для увеличения эффективности фотохимической интернализации, обусловлен взаимодействием трех компонентов – фотосенсибилизатора, света и кислорода. Поэтому можно предполагать, что повышение содержания кислорода в ближайшем окружении фотосенсибилизатора должно способствовать повышению эффективности фотодинамического эффекта.
Известно, что перфторорганические соединения способные растворять кислород в 10-20 раз лучше, чем вода, а значит, гннеопция синглетного кислорода будет увеличиваться, если в полимерные носители для фотохимической интернализации вводить фторуглеродные фрагменты, и затем включить в такие конструкции фотосенсибилизатор. В настоящем разделе мы покажем результаты по разработке способов синтеза таких систем, их фотосенсибилизирующей активности в модельной системе и их фототоксичности на клетках в культуре.
8.2.1. Синтез блок-сополимеров гексафторбутилметакрилата и полиэтиленоксида.
Блок-сополимер гексафторбутилметакрилата и полиэтиленоксида был синтезирован методом псевдоживой радикальной полимеризации с переносом атома ATRP. При этом два из исследованных образцов были синтезированы обычным методом ATRP, а еще методом ATRP в модификации «генерации активатора за счет переноса электрона» (AGET ATRP), предложенной К. Матиашевским в 2005 г. [ ]. Данный подход, в применении к исследованной системе, предполагает (1) присоединение галоидного алкила к первому блоку (полиэтиленоксиду) (Рисунок 22а) и (2) полимеризацию гексафторбутилметакрилата (6ФБМА) в присутствии модифицированного полиэтиленоксида (макроинициатора), дибромида меди(II), лиганда (пентаметилдиэтилентриамина) и восстановителя, в качестве которого использовали аскорбиновую кислоту или октаноат олова (II) (Рисунок 22б).
В данной схеме инициирование происходи за счет обратимой реакции комплекса ионов одновалентной меди (Cu(I)), который генерируется in situ за счет реакции переноса электрона от восстановителя к комплексу меди (II) (рисунок 22б). Далее образовавшийся радикал реагирует с двойной связями гексафторбутилметакрилата, за счет чего начинается рост полимерной цепи. Однако, поскольку реакция между комплексом меди и галоидным алкилом обратима, двухвалентная медь может опять окислять радикал роста, перенося на него атом брома («спящее состояние»), переходя при этом в степень окисления (I). Рост полимерной цепи достигается за счет многократного повторения актов «засыпания»-регенерации радикалов роста.
Состав и молекулярно-массовые характеристики синтезированных блок-сополимеров показаны в таблице 2. Видно, что по мере роста длины гидрофобного блока увеличивается ширина молекулярно-массового распределения. Это, в первую очередь связано с тем, что по мере увеличения количества гидрофобных звеньев, в препарате сополимера увеличивается доля остаточного макроинициатора или короткоцепочечного блок-сополимера. По всей видимости, это вызвано тем, что, по мере увеличения степени полимеризации, фторированные блоки могут выделяться в отдельную фазу вследствие ограниченной термодинамической совместимости. В результате, процесс роста происходит в основном в микрофазе фторированного полимера, а цепи макроинициатора, не содержащие или содержащие малое количество 6ФБМА звеньев, не участвуют в полимеризации вообще. Например, в образце №3, в котором по данным 1Н-ЯМР спектроскопии содержалось около 46% (масс.) фтор-содержащего мономера, оставалось около 20-30% немодифицированного или слабо модифицированного полиэтиленоксида.
Таблица 1. Молекулярно-массовые характеристики блок-сополимеров полиэтиленоксида и гексафторбутилметакрилата.
№ Состав сополимера по 1Н-ЯМР Mn Mw Mw/Mn Степень полимеризации блока 6ФБМА
1. mPEG1146ФБМА3.8 8530 10075 1.18 14
2. mPEG1146ФБМА6.7 11435 14285 1.25 26
3. mPEG1146ФБМА17.2 12911 18690 1.45 32
Мицеллообразование в водных растворах блок-сополимеров изучали методом динамического светорассеяния. Оказалось, что все синтезированные сополимеры образовывали мицеллы в водном растворе. Методом динамического светорассеяния было показано, что в растворах сополимеров регистрируются частицы со средним гидродинамическим радиусом 10-15 нм (быстрая фракция) и около 100 нм (медленная фракция). В растворах сополимеров, содержащих в среднем 7 или 17 гидрофобных звеньев, регистрировались также более крупные частицы со средним гидродинамическим радиусом около 300-400 нм.
Критическая концентрация мицеллообразования сополимеров была определена по солюбилизации гидрофобного зонда 2,4,6-дифенилгексатриена, флуоресценция которого повышается при появлении в растворе мицеллярной микрофазы (Рисунок 24). Оказалось, что критическая концентрация мицеллообразования сополимеров была достаточно мала. Даже для наименее гидрофобного сополимера ПЭГ114-6ФБМА3.8 эта величина составляла около 0.07 мг/мл и уменьшалась с ростом содержания гидрофобного сомономера. (Таблица 2).
Таблица 2. Значения ККМ сополимеров ПЭГ-6ФБМА.
# Состав сополимера ККМ, мг/мл
1 ПЭГ1506ФБМА3.8 0.069
2 ПЭГ1506ФБМА7 0.027
3 ПЭГ1506ФБМА18 0.022
|
| Результаты этапа: Цель данного проекта состояла в выявлении наиболее эффективных подходов к повышению иммуногенности противовирусных ДНК- и РНК-вакцин, включая подбор оптимальных носителей нуклеиновой кислоты и условий активации трансфекции клеток млекопитающих in vivo. В качестве модельных антигенов в опытах по иммунизации мышей использовали протективные белки ротавирусов человека и кодирующие их нуклеиновые кислоты (плазмидная ДНК и мРНК). Для достижения этой цели надо было решить несколько основных задач: (1) разработать генетические конструкты, кодирующие протективные антигены ротавируса VP7 и VP4; (2) подобрать полимерные носители для доставки ДНК-вакцин в клетки; изучить эффективность экспрессии модельного репортерного гена в культурах клеток in vitro с использованием разных носителей ДНК; изучить эффективность метода фотохимической интернализации для активации трансфекции в культуре клеток; (4) разработать тест-системы на основе иммуноферментного анализа и реакции нейтрализации для оценки поствакцинального иммунитета у мышей в ответ на введение кандидатных ДНК-вакцин и (5) исследовать эффективность разрабатываемых подходов на лабораторных животных.
За отчетный период были получены рекомбинантные плазмиды и мРНК, кодирующие протективные белки ∆VP8*P[8] и ΔVP8*P[4] ротавирусов, а также в прокариотической системе экспрессии наработаны соответствующие белковые антигены в количествах достаточных для иммунизации. В качестве маркерного материала для регистрации трансфекции была также получена мРНК светляковой люциферазы, при трансфекции которой культуры клеток СНО в лизатах клеток регистрировалась люциферазная активность. Была разработана иммуноферментная тест-система, а также оригинальная тест-система для определения титра вирус-нейтрализующих антител, основанная на определении титра вируса путем ОТ-ПЦР-анализа лизатов зараженных клеток в смеси сыворотка-вирус на следующий день после заражения.
Был синтезирован целый ряд поликатионных носителей для трансфекции: водорастворимые производные хитозана, линейный и сетчатые полимеры (N,N-диметиламиноэтилметакрилата) (ПДМАЭМА), линейный полиэтиленимин, содержащий дисульфидные мостики, статистический сополимер ДМАЭМА и N-винилпирролидона. Для всех исследованных сополимеров, а также для коммерческих препаратов линейного полиэтиленимина, протамин сульфата и блок-сополимера олигопропиленгликольакрилата и ДМАЭМА, синтезированного в лаборатории ранее, была исследована трансфекционная активность как в отсутствие фотосенсибилизатора, так и в условиях фотохимической интернализации. Для всех исследованных полимеров были определены области нетоксичных концентраций и показано, что цитотоксичность линейных сополимеров уменьшается с увеличением доли незаряженных звеньев, а, в случае сетчатых полиэлектролитов, снижается по мере увеличения степени сшивки. Из всех исследованных систем, лишь линейный полиэтиленимин, продукт его модификации с введением дисульфидных мостиков, а также блок-сополимер олигопропиленгликоль-акрилата и ДМАЭМА проявляли трансфекционную активность в опытах in vitro достаточную для их использования в экспериментах на животных. Наибольшее увеличение трансфекции за счет эффекта фотохимической деструкции эндосом наблюдалось при использовании протамин сульфата в качестве носителя ДНК и дисульфоалюмофталоцианина в качестве фотосенсибилизатора. При этом уровень экспрессии маркерного гена увеличивался более чем на 2 порядка.
При исследовании иммуногенности различных препаратов были проанализированы лабораторные штаммы ротавирусов, рекомбинантный белок ΔVP8*P[8], плазмидная ДНК и мРНК. Для оценки иммуногенности разных препаратов в сыворотках иммунизированных и контрольных мышей методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли уровень специфических антител, а в реакции нейтрализации вируса в культуре клеток МА-104 – уровень вируснейтрализующих антител. В качестве основного маркера иммуногенности исследуемых препаратов ДНК и белков выбран прирост специфических антител, поскольку гуморальный иммунный ответ играет ведущую ролью в формировании приобретенного противоротавирусного иммунитета.
Препараты нуклеиновых кислот, кодирующих ΔVP8*P[8] (мРНК и пДНК), при некоторых способах и режимах иммунизации не обеспечивали прироста антител к соответствующему рекомбинантному белку, либо прирост был весьма незначительным и/или статистически недостоверным. Так, мы не обнаружили значимого прироста IgG и IgA антител в сыворотках крови и фекалиях животных, иммунизированных пДНК (внутривенно в комплексе с ПЭИ 25 кДа; подкожно с электропорацией и без; внутрикожно комплексами протамин сульфат/пДНК с фотохимической активацией в присутствии AlPcS2), а также мРНК в комплексе с протамин сульфатом при внутрикожном введении.
Вместе с тем, при разных режимах внутримышечного введения мышам пДНК наблюдался выраженный иммунный ответ в виде прироста титров IgG к белку ΔVP8*P[8] и вируснейтрализующих антител. Титр антител класса G при внутримышечном введении плазмидной ДНК после 3-й иммунизации с электропорацией был достоверно выше по сравнению с условиями без электропорации, при этом однако оставался ниже титра при иммунизации рекомбинантным белком примерно на 2 порядка. Наибольший прирост титров антител к белку ΔVP8*P[8] наблюдался у мышей, подкожно иммунизированных препаратами рекомбинантного белка ΔVP8*P[8] - после третьей иммунизации он превышал 5 lg. Наиболее ценный и информативный результат заключался в том, что сыворотки мышей, иммунизированных пДНК (внутримышечно), так же, как и рекомбинантным белком (подкожно) и ротавирусом (внутрибрюшинно), обладают выраженной способностью нейтрализовать ротавирус для культуры чувствительных клеток МА-104. При этом титр нейтрализующих антител при иммунизации пДНК с электропорацией (1:1280) в 4 раза превышал титр для пДНК без электропорации, и был всего в 2 раза ниже титра для рекомбинантного белка.
Полученные результаты демонстрируют перспективность разработки ротавирусной вакцины с использованием в качестве иммуногена как рекомбинантного белка ΔVP8, полученного в клетках E. coli, так и плазмидной ДНК с геном этого белка. Из числа изученных нами подходов к повышению иммуногенности ДНК наилучший результат обеспечивал режим внутримышечной инъекции плазмидной ДНК с последующей электропорацией, что согласуется с результатами других исследований.
|
