ИСТИНА

Известно, что присоединение трипептида глутатиона, несущего отрицательный заряд, к SH-группам белков может привести к значительному изменению их конформации. Ранее мы установили, что в препаратах очищенной Na,K-АТФазы 12 из 15 экспонированных в цитозоль SH-групп каталитической (альфа) субъединицы могут содержать связанный глутатион. Связывание глутатиона с остатками цистеина 454, 458 и 459 приводит к ингибированию ферментативной активности (Petrushanko et al., 2012, J. Biol. Chem., 287:32195-205). Глутатионилирование остальных 9 SH-групп альфа-субъединицы на активность фермента не влияет. В предлагаемом проекте планируется иссследовать влияние избирательного глутатионилирования различных SH-групп каталитической субъединицы Na,K-АТФазы на ее устойчивость к протеолизу и на термостабильность.

В рамках проекта были поставлены следующие задачи: 1. Получить очищенную Na,K-АТФазу из солевых желез утки (альфа1-изоформа), глутатионилированную по разным остаткам цистеина . 2. Исследовать ограниченный протеолиз альфа1-изоформы Na,K-АТФазы, глутатионилированной по разным остаткам цистеина, под действием трипсина, химотрисина, а также протеаз К7 и V8. 3. Исследовать термоинактивацию и термоденатурацию Na,K-АТФазы, альфа1-субъединица которой глутатионилирована по различным остаткам цистеина. 4. Исследовать ограниченный протеолиз альфа-2 субъединицы Na,K-АТФазы, глутатионилированной в различной степени, в составе фракции микросом из сердца крысы. В течение 2015 года было установлено, что цистеиновые остатки каталитической субъединицы Na,K-АТФазы можно разделить на три группы: 1) остатки, глутатионилированные исходно (12-13 остатков цистеина); 2) остатки, с которых невозможно удалить связанный глутатион в присутствии сильного восстановителя (3% боргидрид натрия) даже в денатурирующих условиях (сохраняется около 40% глутатионилированных групп от исходного глутатионилированного состояния, то есть не менее 6 остатков цистеина, среди которых были обнаружены 5 глутатионилированных остатковб включая Cys454, 458, 459, 513, 658; 3) остатки, которые глутатионилируются in vitro при добавлении окисленного глутатиона (дополнительно глутатионилированные остатки). Методом масс-спектрометрии было установлено, что это остатки Сys 244, 458 , 456 и 459, глутатионилирование которых приводит к полному ингибированию активности фермента. Они были отнесены к регуляторным остаткам, которые могут быть модифицированы при окислительном стрессе. Активность фермента может быть восстановлена после возвращения клетки к нормальным редокс-условиям с использованием системы сопряженных ферментов глутаредоксин-глутатионредуктаза. Метод масс-спектрометрии показал, что выделенный фермент, альфа-субъединица которого содержит связанный глутатион, имеет и другие модификации SH-групп остатков цистеина, многие из них окислены до -SOH, -SO2H и -SO3H, а также нитрозилированы. По данным масс-спектрометрии один и тот же остаток цистеина альфа-субъединицы фермента может содержать 3-4 модификации одновременно (то есть, в разных молекулах альфа-субъединицы могут быть различные модификации одного и того же остатка цистеина ). Однако обработка восстановителями, в частности, боргидридом натрия существенно снижает степень окисления (более чем на 50%), а также нитрозилирования (на 20%) остатков цистеина. По-видимому, глутатионилирование может защищать SH-группы остатков цистеина от необратимого окисления до SO2H и -SO3H. В течение 2016 года было установлено, что при обработке исходно глутатионилированной Na,K-АТPазы трипсином в присутствии NaСl (конформация Е1) сначала появляется фрагмент с молекулярной массой ~80 кДа, который был описан ранее в классической работе П. Йоргенсена, а затем наблюдается образование фрагментов с молекулярной массой 40, 35,5 и 23 кДа (продукты так называемого «вторичного» протеолиза). Трипсинолиз исходно глутатионилированной Na,K-АТРазы в среде с KCl (конформация E2) проходит аналогичным образом: появляются фрагменты почти с такими же молекулярными массами 40, 35,5 и 23 кДа. Деглутатионилирование фермента путем обработки его 3% боргидридом натрия существенно увеличивает скорость трипсинолиза как в среде с КСl, так и в среде с NaCl. Характер протеолиза дополнительно глутатионилированного препарата, который мы получали путем его обработки 1 мМ окисленным глутатионом, в среде с KCl трипсинолиз происходит аналогично этому процессу в частично деглутатионилированном препарате. В среде с NaCl трипсинолиз осуществляется подобно тому, как он происходит с исходно глутатионилированным ферментом. В присутствии уабаина (конформация E2-уабаин) трипсинолиз альфа-субъединицы происходит значительно быстрее, чем в конформациях Е1 и Е2: уже через 5 минут среди продуктов протеолиза появляется фрагмент с молекулярной массой 23 кДа. Предварительная обработка Na,K-АТPазы 3% боргидридом натрия, снижающая степень глутатионилирования альфа-субъединицы, увеличивает скорость накопления низкомолекулярных фрагментов. Обработка Na,K-АТPазы окисленным глутатионом, вызывающая дополнительное глутатионилирование остатков цистеина альфа-субъединицы, увеличивает содержание более высокомолекулярных фрагментов по сравнению с нативным и деглутатионилированным препаратами. Полученные результаты свидетельствуют о том, что дополнительное глутатионилирование влияет на конформацию фермента и увеличивает его устойчивость к трипсинолизу по-разному в зависимости от конформации, но особенно значительное увеличение устойчивости к трипсинолизу под действием глутатионилирование наблюдается после связывания с ферментом уабаина. В течение последнего года выполнения проекта исследования были посвящены в основном продолжению изучению трипсинолиза, а также химитрипсинолиза и термостабильности очищенной Na,K-АТФазы из солевых желез утки, каталитическая субъединица которой была глутатионилирована в различной степени. Было показано, что после частичного деглутатилонилирования фермента химотрипсинолиз фермента в конформации Е1 (в присутствии NaCl) происходит медленнее, чем при его исходном глутатионилировании. Не было отмечено изменения скорости и набора продуктов химотрипсинолиза в дополнительно глутатионилированном препарате фермента. Помимо этого было установлено, что при инкубации исходно глутатионилированной, дополнительно глутатионилированной и частично глутатионилированной Na,K-АТФазы с протеазой неприлизин, который расщепляет альфа-субъединицу фермента внутри мембраны на два примерно одинаковых фрагмента (с молекулярной массой около 55 и 48 кДа) изменений в скорости протеолиза и наборе продуктов не наблюдается. В течение последнего года выполнения проекта было исследовано действие на Na,K-АТФазу с протеазв V8, расщепляющей пептидные связи, рядом с которыми со стороны С-конца располагаются отрицательно заряженные аминокислоты. Оказалось также, что альфа1- и альфа-2 изоформы Na,К-АТФазы крайне устойчивы к действию этой протеазы, при этом изменение степени глутатионилирования фермента не сказывалось на скорости протеолиза его альфа-субъединицы. В течение 2016 года было установлено, что исходно глутатионилированная Na,K-АТФаза не теряет активность при нагревании до температуры 52 С, после чего начинается резкое падение активности, полная потеря активности происходит при температуре 60 С. Сравнение кривой термоинактивации исходно глутатионилированной, частично деглутатионилированной и дополнительно глутатионилированной Na,K-АТФазы показало, что термостабильность фермента зависит от степени глутатионилирования его каталитической субъединицы: а именно, частичное деглутатионилирование в присутствии боргидрида натрия повышает температуру при которой начинается термоинактивация до 54-55 С, в то время как дополнительное глутатионилирование не влияет на характер кривой термоинактивации. При этом полная потеря активности во всех случаях наблюдается при температуре около 60 С. Параллельно было проведено исследование корреляции между термоинактивацией, степенью глутатионилирования фермента и образованием его олигомеров. Оказалось, что для исходно глутатионилированной Na,K-АТФаза при температурах выше 45 С характерно образование олигомеров, а именно три и тетрамеров (альфа2-бета2)3 и (альфа2-бета2)4, причем количество олигомеров при высоких температурах значительно больше для исходно глутатионилированного препарата по сравнению с частично глутатионилированным ферментом. Таким образом, защита от термоинактивации, наблюдаемая при повышении степени глутатионилирования может быть связана с повышенной способностью такого препарата к образованию олигомеров. В течение 2017 года было проведено также исследование устойчивости к трипсинолизу альфа2-субъединицы Na,K-АТФазы из сердца крысы, глутатионилированной в различной степени. Дополнительное глутатионилирование фермента не влияет на скорость и трипсинолиза альфа2-субъединицы. Однако частичное деглутатионилирование фермента резко увеличивает скорость протеолиза этого белка (скорость протеолиза возрастает примерно в 4 раза). Дополнительное глутатионилирование фермента путем его обработки окисленным глутатионом на скорость трипсинолиза его альфа-субъединицы по сравнению с исходно глутатионилированным ферментом не влияет.