![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Процесс транскрипции хроматина происходит у всех высших организмов. Недавно было установлено, что экспрессия тысяч генов человека регулируется на стадии элонгации транскрипции хроматина, и многие белковые регуляторы этого процесса участвуют в онкогенезе и старении человека. В то же время механизмы элонгации транскрипции хроматина и регуляция этого процесса пока недостаточно изучены. В настоящем проекте будут определены механизмы элонгации транскриптов в хроматине РНК-полимеразой 2, а также механизмы регуляции данного процесса белком-шапероном Asf1. Механизмы будут охарактеризованы в терминах структур интермедиатов высокого разрешения и скорости их формирования/распада с использованием междисциплинарного подхода, включающего разработку и использование новейших биохимических, молекулярно-биологических, биоинженерных и физико-химических методов, а также методов компьютерного моделирования и биоинформатики. Исследования будут выполняться квалифицированными специалистами, обладающих высоким рейтингом научных публикаций, опытом работы над масштабными проектами самого высокого уровня, включая гранты Правительства Российской Федерации (в т.ч. «мегагрант») и Министерства образования и науки по теме проекта. Коллектив имеет документированный в десятках экспериментальных научных работ, обзорах и патентах опыт исследований в области проекта, а также многолетний опыт работы с современными экспериментальными подходами, предлагаемыми для дальнейшей разработки. Поскольку проект посвящен исследованию нового фундаментального механизма регуляции экспрессии генов и будет выполняться с использованием новейших междисциплинарных экспериментальных подходов, полученные результаты будут интересны широкому кругу учёных, от биологов до физиков. Разработанный комплекс подходов найдёт широкое применение при реализации проекта, а впоследствии и для анализа различных других сложных биологических процессов, включающих множественные факторы и сложную динамику. Кроме того, процесс транскрипции хроматина важен для жизнеспособности клетки, а шаперон гистонов Asf1 вовлечен в онкогенез и преждевременное старение и является перспективной мишенью для разработки противоопухолевых препаратов нового поколения. Поскольку результаты проекта будут востребованы при разработке противоопухолевых препаратов и, возможно, лекарств, предотвращающих преждевременное старение, проект будет иметь важное социальное значение, а также важен для медицины и народного хозяйства.
The process of transcription in chromatin is fundamental to all eukaryotes. Recently it has been discovered that the expression of thousands of human genes is regulated at the stage of transcript elongation and that many protein regulators of this process are involved in carcinogenesis and aging. At the same time, mechanisms of transcript elongation in chromatin and the regulation of this process are still poorly studied. This project is dedicated to analysis of the mechanisms of transcript elongation in chromatin by RNA polymerase II and regulation of this process by a histone chaperone Asf1. The underlying mechanisms will be described in terms of the high-resolution structures of the intermediates formed during this process and the rates of their interconversion. The project will be executed using an interdisciplinary approach, including the development and use of modern biochemical, molecular biology, bioengineering, chemical and physical methods, and the methods of computer modeling and bioinformatics. The studies will be conducted by highly qualified experts having long-term experience in work on large interdisciplinary projects of the highest level, including research funded by "megagrant" and grants from the Ministry of education and science on the topic of the project. The team has vast research experience in the field of the project, as well as long experience with modern experimental approaches targeted for further development. Since the project is devoted to the new fundamental mechanism of gene regulation and will be carried out using the latest interdisciplinary experimental approaches, the results will be interesting to a wide audience of scientists, from biologists to physicists. The developed methodologies and approaches will be useful for analysis of a variety of other complex biological processes involving multiple factors and the complex dynamics. The process of transcription in chromatin is essential for cell viability; the histone chaperone Asf1 is involved in oncogenesis and premature aging, and is a promising target for the development of anticancer drugs of new generation. Therefore the results of the project will be essential for the development of new anticancer drugs and possibly medications that prevent premature aging, and the project will have significant social value and is important for medicine and national economy.
В результате проекта будут разработаны комплексные, современные подходы (включая мономолекулярные и подходы с высоким временным разрешением) к изучению стадии элонгации транскрипции и определены механизмы формирования нуклеосомного транскрипционного барьера, а именно: (а) участки и последовательности нуклеосомной ДНК, гистонов и РНКП2 участвующие в его формировании; (б) структуры ключевых интермедиатов, обеспечивающих остановку и дальнейшую транскрипцию РНКП2; (в) определены константы скорости перехода между этими интермедиатами. Будут определены механизмы сохранения гистонов и эпигенетического статуса клетки во время транскрипции: (а) структуры ключевых интермедиатов, обеспечивающих сохранение гистонов на ДНК; (б) механизмы действия белковых факторов, участвующих в этом процессе. Будут установлены механизмы, обеспечивающие эффективную транскрипцию нуклеосом, расположенных в кодирующих областях генов: (а) эффект ключевых белковых факторов на транскрипцию хроматина будет описан в терминах изменения структур ключевых интермедиатов и скоростей перехода между ними; (б) будут определены функциональные домены и участки белковых факторов и их мишеней. Поскольку экспрессия тысяч эукариотических генов регулируется на стадии элонгации транскрипции и процесс транскрипции хроматина происходит у всех эукариотических организмов, результаты проекта будут, несомненно, высокозначимы и интересны широкому кругу учёных. Проект будет руководиться и выполняться ведущими российскими учёными, имеющими высокую международную репутацию, с использованием новейшего оборудования и современных методологий – поэтому результаты будут соответствовать мировому уровню исследований. Наконец, процесс транскрипции важен для нормального функционирования клетки и его нарушения приводят к преждевременному старению и вызывают онкогенез; в частности, многие факторы, участвующие в транскрипции хроматина, являются важными мишенями для противораковых препаратов. Поэтому результаты этого проекта, несомненно, имеют важное значение для медицины, социальной сферы и экономики страны (предотвращение преждевременного старения и создание противораковых препаратов следующего поколения).
Было установлено, что в ходе транскрипции РНК-полимеразами S.cerevisiae и E.coli нуклеосомных матриц 603 и 601R основными районами образования интермедиатов являются позиции +(11–15), +(26-27), +(35–37), и +(45–48) п.н. от промотор-проксимальной границы нуклеосомы. Скорости превращения остановленных (не продуктивных) комплексов в продуктивные были проанализированы в ходе транскрипции на 603 нуклеосомной матрице, что позволило установить медленные и быстрые стадии прохождения РНКП через нуклеосому. Было показано, что основными интермедиатами, лимитирующими прохождение РНКП через нуклеосому, являются комплексы, образуемые на участках +11-+15, +26-+27, +35-+37 и +45-+48 относительно промотор-проксимальной границы нуклеосомы. Полученные данные вносят существенный вклад в дополнение модели нуклеосомного цикла. Методами футпринтинга ДНК с использованием ДНКазы I и гидроксильных радикалов были изучены структуры ключевых интермедиатов транскрипции – элонгационных комплексов ЭК(+24), ЭК(+42) и ЭК(+49). Установлено, что в комплексах ЭК(+24) и ЭК(+49) наблюдается частичная защита промотор-проксимального участка ДНК (-(30-1) и +(1-15), соответственно). Таким образом, в них происходит образование петлевого транскрипционного интермедиата. Установлено, что в ЭК(+42), напротив, наблюдается открытая конформация промотор-проксимального участка ДНК +(1-25), то есть в этом ЭК не происходит образования внутринуклеосомной петли ДНК с включенной РНКП. Исходя из полученных данных, построены модели структур изученных ЭК. Сравнительное исследование структур ЭК позволило построить модель изменения конформации нуклеосомы при движении РНК-полимеразы в промотор-проксимальной области и существенно улучшить понимание процесса транскрипции нуклеосом (т.н. «нуклеосомного цикла»). Разработаны наборы флуоресцентно-меченых мононуклеосом с метками проксимальной (Су3 +13; Су5 +91), срединной (Су3 +35; Су5 +113) и дистальной (Су3 +56; Су5 +135) областях, с помощью которых методом spFRET можно изучать реорганизацию нуклеосомальной ДНК в разных участках нуклеосомы, а также в элонгационных комплексах, остановленных в некоторых функционально важных положениях: -39, -5, +24, +48, +49. Методом spFRET охарактеризованы структурные особенности комплексов ЭК(-39), ЭК(-5), ЭК(+24), ЭК(+48), ЭК(+49) и предложена рабочая модель, объясняющая эти особенности. Разработана оригинальная методика анализа FRET флуоресцентно-меченых нуклеосом и их ЭК в полиакриламидном геле после электрофореза, которая обеспечила возможность прямого сравнения данных о различных ЭК, получаемых биохимическими подходами, с данными, получаемыми spFRET-микроскопией. В ходе работы были разработаны разнообразные методы моделирования нуклеосом и элонгационных комплексов, включая, методы интегративного моделирования, позволяющие учитывать экспериментальные данные при построении молекулярных моделей. На основе данных методов рассчитаны модели нуклеосом, получаемые в результате приложения внешних напряжений и потери отдельных гистонов, используемые для построения моделей элонгационных комплексов. Разработаны методы эмпирического моделирования ДНК, позволяющие находить оптимальную геометрию свободных участков ДНК в составе комплексов. Разработаны методы интерпретации данных spFRET и методы предсказания оптимальных позиций меток при дизайне экспериментов. На основе интеграции данных методов просвечивающей электронной микроскопии, футпринтинга ДНК, данных spFRET и методов молекулярного моделирования построены структуры +24 и +42 комплекса РНКП2 с нуклеосомой. Разработанные методы применялись также для построения моделей разворачивания нуклеосом белком FACT. С помощью метода просвечивающей электронной микроскопии макромолекул впервые получены трехмерные структуры двух элонгационных комплексов РНКП E.Coli с нуклеосомой, остановленных в положениях (+24) и (+42) при транскрипции нуклеосомной ДНК; впервые исследовано влияние введения однонитевого разрыва в нематричную цепь ДНК на трехмерную структуру элонгационного комплекса. С помощью метода компьютерного моделирования построены модели возможных трехмерных структур исследуемых комплексов. Методом молекулярной динамики оценено влияние введения однонитевого разрыва на механические свойства ДНК: показано уменьшение жесткости в структуре с однонитевым разрывом по сравнению с нормальной структурой ДНК. Предложен возможный механизм остановки транскрипции в элонгационном комплексе (+24) с однонитевым разрывом в положении +12 нематричной цепи нуклеосомной ДНК. Полученные результаты имеют практическое значение для изучения регуляции транскрипции и репарации ДНК. Нарушения этих процессов, отвечающих за уровень генной экспрессии, способны приводить к развитию различных заболеваний, в том числе онкологической и нейродегенеративной природы. Результаты работы могут послужить в дальнейшем для разработки новых лекарственных средств, методов диагностики и новых подходов к изучению механизмов и способов профилактики данных патологий. На основе TIRF-микроскопии разработана методика измерений spFRET и анализа конформационных изменений ДНК в составе одиночных иммобилизованных нуклеосом с временным разрешением около 100 мс. С использованием разработанной системы быстрого впрыска нуклеотидов в микрофлюидную ячейку обеспечена возможность запуска транскрипции в режиме непрерывного измерения изображений от иммобилизованных комплексов с «мертвым временем» меньше 1,5 секунд и временным разрешением около 100 мс. Разработаны полуавтоматические процедуры обработки данных, облегчающие и ускоряющие анализ иммобилизованных мононуклеосом методом spFRET-TIRF-микроскопии. Методом spFRET-TIRF микроскопии проведены эксперименты по изучению различных иммобилизованных элонгационных комплексов, а также исследования транскрипции иммобилизованных нуклеосом в динамике в реальном времени. Ведется оптимизация способа модификации (пассивации) поверхности, чтобы снизить ее влияние на изучаемые процессы. Методом жесткого докинга с использованием структур нуклеосом и элонгационного комплекса дрожжевой РНКП 2 (структуры ПДБ 3LZ0 и 1Y1W, соответственно) построена атомистическая модель ключевого ЭК+49. Используя построенную модель ЭК+49, были идентифицированы три предполагаемые поверхности взаимодействия между РНКП 2 и гистонами в комплексе. На основе предсказаний модели сконструированы и получены мутантные варианты РНКП 2, с помощью которых подтверждены основные выводы, сделанные на основе построенной модели. Были получены и траснкрибированы нуклеосомы 603 (содержащие и не содержащие N-концы гистонов Н2А/Н2В). Удаление N-концов гистонов Н2А/Н2В приводит к более эффективной транскрипции участков +15 и +45 нуклеосомной ДНК, как и предполагалось на основании анализа модели ЭК+49. Метод spFRET микроскопии был впервые применен для изучения структурной организации ДНК за границей нуклеосомы в комплексах с линкерным гистоном Н1. Для этого с учетом данных молекулярного моделирования разработаны нуклеосомы с флуоресцентными метками в различных участках линкерной ДНК: (Cy3 -20; Cy5 +172), (Cy3 -18; Cy5 +166), (Cy3 -15; Cy5 +164), (Cy3 -10; Cy5 +161). Показано, что метод spFRET и разработанные нуклеосомы являются новым высокочувствительным инструментом для изучения хроматосом и их взаимодействий с различными белковыми факторами. Исследованы комплексы нуклеосом с линкерным гистоном Н1.5 и делеционными вариантами этого гистона: 1-127, 35-120 и 1-177. С применением методов молекулярного моделирования построена модель комплекса Н1.5 с нуклеосомой, которая учитывает полученные методом spFRET данные. Однонитевые разрывы представляют собой один из самых распространенных видов повреждений ДНК. Одной из задач проекта являлось изучение влияния таких разрывов на процесс транскрипции. Проведенные нами исследования показали, что разрывы ДНК в некоторых положениях на нуклеосомной ДНК затрудняют транскрипцию, а в других положениях, наоборот, облегчают прохождение фермента через нуклеосому. Для детального изучения действия однонитевых разрывов на транскрипцию в рамках выполнения проекта была разработана методика получения нуклеосомных матриц с уникальными позиционированными однонитевыми разрывами нематричной цепи. С помощью таких матриц было выявлено, что только при организации ДНК в нуклеосому однонитевые разрывы могут вызывать количественную остановку элонгирующей РНКП. В частности, было показано, что разрывы в +12 или +17 положениях вызывают остановку фермента в положении +24, +22 – в +34, а +31 – в +44. Действие разрывов было связано с формированием переходных неактивных петлевых комплексов, разрешение которых зависит от возможности накопления напряжений в нуклеосомной ДНК. Полученные данные позволили существенно дополнить теоретические знания о процессе элонгации в хроматине и предположить существование новых, хроматин-специфичных механизмов удаления поврежденной ДНК. По полученным данным готовятся публикации, в том числе опубликованы статьи в журналах Science Advances (2015) и Transcription (2016). В экспериментах по транскрипции РНКП 2 S.cerevisiae мононуклеосомной матрицы 603 было установлено, что гистоновый шаперон Asf1 увеличивает выход полноразмерных транскриптов и высвобождение нуклеосом без сопутствующей диссоциации нуклеосомной ДНК в ходе транскрипции, снижая барьер для прохождения РНКП через нуклеосому. В присутствии Asf1 фермент легче преодолевает нуклеосомный барьер в положениях +35 и +47 от начала нуклеосомы и не вытесняет нуклеосомы с ДНК во время транскрипции. Предложена модель действия Asf1, предполагающая, что этот белок взаимодействует с временно доступными в нуклеосоме поверхностями октамера гистонов, открывающимися во время транскрипции и, такими образом, нарушает ДНК-гистоновые контакты в нуклеосоме, снижая высоту транскрипционного барьера и способствуя сохранению нуклеосом. При анализе транскрипции in vitro на полинуклеосомных матрицах установлено, что ее эффективность увеличивается с ростом числа нуклеосом и концентрации ионов магния. N-концы коровых гистонов негативно влияли на сохранение нуклеосом в ходе транскрипции, а повышение числа нуклеосом на матрице способствовало их сохранению. Оба H2A/H2B димера высвобождались в ходе транскрипции как длинных, так и коротких матриц со сходной высокой вероятностью. Методом spFRET-микроскопии показано, что дрожжевой белковый комплекс FACT может обратимо и АТФ-независимо раскручивать нуклеосомную ДНК in vitro. Разворачивание происходит симметрично и без потери гистонов, по механизму «все или ничего». Мутантный вариант комплекса FACT, известный в литературе как FACT(Spt16-11), раскручивает нуклеосомы хуже, чем интактный комплекс. Определенные мутации в гистонах, которые компенсируют in vivo мутации в FACT(Spt16-11), также восстанавливают активность шаперона гистонов и in vitro. Сделан вывод, что FACT-опосредованное масштабное разворачивание нуклеосомной ДНК является важной функцией белкового комплекса in vivo. В исследованиях по репликации позиционированных мононуклеосом T7 реплисомой in vitro установлено, что нуклеосомы формируют высокий, сиквенс-специфичный, барьер для репликации, с особенно сильным паузированием ДНК полимеразы в +(31–40) и +(41–65) участках нуклеосомной ДНК. Наличие свободной ДНК облегчает прохождение полимеразы через нуклеосому; после репликации, минимум 50% нуклеосом изменяют свою конформацию, сохраняя свое положение на ДНК. Предложены возможные пути реорганизации хроматина во время/после репликации in vivo. Показано, что расстояния между нуклеосомами, а также присутствие более протяженных участков ДНК, не занятых нуклеосомами, способны как положительно, так и отрицательно модулировать структуру и динамику хроматина, таким образом влияя на скорость энхансер-промоторной коммуникации (ЭПК) in vitro и in silico. Увеличение межнуклеосомного расстояния с 25 до 60 п.н. увеличивает эффективность ЭПК. Наличие же более протяженных участков ДНК, не занятых нуклеосомами, может как положительно, так и отрицательно влиять на скорость ЭПК в зависимости от их длины и положения в фибрилле хроматина. Таким образом, свободные от нуклеосом участки ДНК позволяют дифференциально регулировать эффективность ЭПК, тем самым модулируя экспрессию генов.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 6 августа 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Эпигенетические механизмы и регуляция транскрипции:структурно-функциональный анализ и разработка новых методов исследования |
Результаты этапа: ДНК человека плотно упакована в ядре клетки с помощью белков (гистонов) в специальный ДНК-белковый комплекс (хроматин). Хроматин состоит из повторяющихся элементов (нуклеосом); каждая нуклеосома состоит из октамера гистонов с навернутыми на него около 200 пар нуклеотидов ДНК. Один из важнейших современных биологических вопросов – как в таком состоянии ДНК происходят различные клеточные процессы? Настоящий проект посвящен исследованию механизмов первого этапа экспрессии генов – транскрипции (синтеза РНК на геномной ДНК в ядре клетки), проводимой в клетке на белок-кодирующих генах РНК-полимеразой 2 (РНКП2), и роли различных белковых факторов в этом процессе. Поскольку нарушения процесса транскрипции хроматина приводят к различным заболеваниям человека (в том числе к различным формам рака) анализ механизмов транскрипции важен как для фундаментальной науки, так и для медицины. На первом этапе проекта наши усилия были сфокусированы на разработке набора новых экспериментальных подходов для анализа механизмов транскрипции хроматина, на выделении белков, синтезе ДНК-матриц, подборе условий для формирования ДНК-белковых комплексов и получении первого набора результатов по определению механизмов транскрипции хроматина. Особое внимание было уделено анализу конформационных переходов в структуре хроматина при транскрипции нуклеосомной ДНК. Решая задачу выяснения механизмов транскрипции хроматина РНКП2 в терминах структур интермедиатов нуклеосомного цикла и скорости их формирования/распада, было установлено, что при транскрипции нуклеосом, точно расположенных на ДНК-матрицах, основные интермедиаты (и соответствующие им паузы в транскрипции) возникают в нескольких четко определенных положениях на нуклеосомной ДНК. Обнаруженные отличия в распределении интермедиатов на различных ДНК-матрицах свидетельствуют о влиянии последовательности ДНК на прохождение фермента через нуклеосому. Разработана математическая модель для описания последовательности формирования интермедиатов, а также методика расчета констант скоростей их формирования (ki+) и распада (ki-). Анализ распределения длин синтезированной РНК в различные моменты времени после инициации транскрипции позволил рассчитать константы скоростей ki+ и ki- обнаруженных интермедиатов и соотнести кинетические стадии со структурами ключевых интермедиатов транскрипции РНКП2. Полученные данные – это первое количественное структурно-функциональное описание сложного процесса транскрипции нуклеосом РНКП2. Методом сайт-направленного мутагеназа были сконструированы специальные ДНК-матрицы, позволяющие остановить транскрипцию в заданных положениях на ДНК-матрице, тем самым сформировав остановленные элонгационные комплексы, соответствующие предполагаемым интермедиатам. Остановленные элонгационные комплексы позволяют изучить структуру интермедиатов транскрипции как биохимическими методами, так и на уровне одиночных нуклеосом методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и флуоресцентной микроскопии на основе эффекта Фёрстеровского резонансного переноса энергии (spFRET). На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) были разработаны новые способы быстрого получения ДНК- матриц, в том числе и с флуоресцентными метками (Су3 и Су5), введенными в три участка нуклеосомы: ближе к месту входа РНКП в нуклесому, в середине нуклеосомы и ближе к выходу РНКП из нуклеосомы. Флуоресцентно-меченные матрицы необходимы для проведения структурного spFRET-анализа одиночных нуклеосом и их комплексов с РНКП. Методом spFRET подтверждено, что в нуклеосомах, собранных на основе этих (Су3/Су5)-меченных ДНК-матриц, реализуется плотная, четко позиционированная укладка ДНК на гистоновом коре. Анализ spFRET-данных выявил наличие в растворах трех субпопуляций частиц, отличающихся по структуре: нуклеосомы, сформированные на октамере гистонов (доминирующая субпопуляция); гексасомы, образующиеся после диссоциации димера гистонов H2A/H2B; нуклеосомы с раскрученной ДНК и свободная ДНК. Впервые методом spFRET микроскопии установлено, что образование открытого комплекса и последующее перемещение РНКП в различные положения до входа в нуклеосому не сопровождаются существенными изменениями в укладке ДНК на октамере гистонов на входе в нуклеосому, на выходе и в ее центральной части. Методом spFRET микроскопии подтверждены биохимические данные о том, что укладка ДНК, характерная для элонгационного комплекса, где РНКП остановлена перед входом в нуклеосому, полностью восстанавливается после прохождения полимеразы через нуклеосому. Обнаруженное сохранение нуклеосом и гистонов вместе с их ковалентными модификациями на исходной позиции ДНК во время транскрипции важно для сохранения эпигенетического статуса клетки. Для исследования методом spFRET с применением флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) структурных перестроек в нуклеосомах в процессе транскрипции была обеспечена возможность иммобилизации флуоресцентно-меченых нуклеосом на стекле. Проведены подготовительные измерения иммобилизованных нуклеосом и их комплексов с РНКП, охарактеризовано влияние иммобилизации на структуру исследуемых комплексов. После завершения оптимизации состава среды метод spFRET-TIRF будет применен для изучения конформационных изменений в структуре одиночных иммобилизованных нуклеосом в процессе транскрипции и под влиянием различных белковых факторов. Линкерный гистон Н1 структурирует укладку ДНК сразу за границей нуклеосомы, способствует формированию компактной фибриллы хроматина и участвует в регуляции транскрипции генов. Для изучения структурной организации ДНК за границей нуклеосомы в комплексах с гистоном Н1 нами было предложено впервые использовать метод spFRET микроскопии. Для решения этой задачи методами макромолекулярного докинга была создана рабочая гипотетическая модель связывания глобулы Н1 с мононуклеосомой, учитывающая последние данные спектроскопии ЯМР. Чтобы определить пространственную укладку ДНК в комплексах с различными вариантами линкерного гистона H1, нами с применением созданной модели были подобраны положения четырех пар флуоресцентных меток на концах ДНК. Введенные пары меток позволят оценить относительные расстояния между различными участками ДНК в изучаемых комплексах. Были созданы соответствующие флуоресцентно-меченые ДНК-матрицы и получен рекомбинантный Н1. На этих матрицах проведена успешная сборка нуклеосом. Подобраны условия связывания и подтверждено образование комплексов полноразмерного гистона Н1 и его укороченных по C- или N- концу фрагментов со всеми вариантами флуоресцентно-меченых нуклеосом. Начинается изучение полученных комплексов методом spFRET микроскопии. Методами проникающей электронной микроскопии (ПЭМ) и молекулярного моделирования была получена первая трехмерная структура элонгационного комплекса РНКП с нуклеосомой, остановленной в положении +42 (разрешение - 18 А). Проведенный структурный анализ выявил, что после того, как РНКП2 встречает нуклеосомный барьер, происходит ряд конформационных переходов в структуре нуклеосом и изменения положения фермента на ДНК, приводящие к блокировке дальнейшего продвижения РНКП. Полученные данные показывают важность аллостерических внутринуклеосомных ДНК-белковых и белок-белковых взаимодействий в ходе конформационных изменений в нуклеосомной структуре в процессе транскрипции и проясняют структурные основы сохранения нуклеосом во время транскрипции. Одноцепочечные разрывы представляют собой один из самых распространенных видов повреждений ДНК. Одной из задач проекта является изучение влияния таких разрывов на процесс транскрипции. Проведенные нами исследования показали, что разрывы ДНК в некоторых положениях на нуклеосомной ДНК затрудняют транскрипцию, а в других положениях, наоборот, облегчают прохождение фермента через нуклеосому. Эти данные позволяют предположить существование новых, хроматин-специфичных механизмов удаления поврежденной ДНК. Для изучения механизмов транскрипции полинуклеосом нами были сконструированы ДНК-матрицы, включающие в себя повторы последовательностей ДНК, обеспечивающих точную посадку нуклеосом и спонтанное формирование наднуклеосомных структур хроматина высших порядков. Проведена сборка полинуклеосом и подтверждено точное позиционирование отдельных нуклеосом в их составе. Проведенные с использованием полинуклеосом исследования показали, что эффективность транскрипции существенно изменяется с ростом ионной силы и с увеличением числа нуклеосом в составе полинуклеосомной фибрилы. Показано, что удаление N-концевых фрагментов гистонов также приводит к значительному изменению эффективности транскрипции полинуклеосомных матриц. Сопоставление, объединение и структурная визуализация комплекса данных, получаемых в проекте современными биохимическими и физико-химическими методами, требует разработки специальных методов молекулярного моделирования. Для решения поставленных задач были разработаны оригинальные алгоритмы моделирования на атомистическом уровне конформационных перестроек нуклеосом под действием внешних напряжений, аналогичных тем, которые возникают в процессе прохождения РНК-полимеразой через нуклеосому. Методами молекулярной динамики проведены успешные тестовые расчеты процессов диссоциации ДНК от гистонового кора и ее обратной ассоциации. Разработаны алгоритмы создания начальных моделей нуклеосом с различной степенью диссоциации ДНК, которые будут уточняться методами молекулярной динамики. Разработаны алгоритмы и программы, для создания атомистических моделей нуклеосом без димеров отдельных гистонов. Впервые получены предварительные атомистические структуры гексасом и тетрасом, являющихся стартовыми для конформационной релаксации методами полноатомной молекулярной динамики. Разработанные методы изучения конформационных перестроек в нуклеосомах будут использованы для интерпретации экспериментальных данных, полученных биохимическими методами и методами FRET, в частности для построения атомистических моделей интермедиатов транскрипции при прохождении РНК-полимеразы через нуклеосому. Все запланированные на первый год проекта исследования и разработки были выполнены в полном объеме. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Эпигенетические механизмы и регуляция транскрипции:структурно-функциональный анализ и разработка новых методов исследования |
Результаты этапа: В ходе второго года работы над проектом была сконструированы и получены методом ПЦР ДНК-матрицы, позволяющие получать элонгационные комплексы (ЭК) с расположением активного центра фермента в +24, +39 и +52 положениях относительно ближайшей к промотору границы нуклеосомы. На полученных матрицах доказана возможность формирования инициаторного (открытого) комплекса; ЭК-39, содержащего 11-мерный участок РНК; ЭК-5, ЭК+24, ЭК+39 и ЭК+52. Показано, что разработанные протоколы обеспечивают получение с высоким выходом ЭК+24, которые пригодны для изучения методами электронной микроскопии. С учетом доказанной возможности формирования ЭК+24, ЭК+39 и ЭК+52 решено ввести в состав разработанных матриц донор-акцепторные пары флуорофоров и использовать флуоресцентно-меченые нуклеосомы для изучения структур комплексов ЭК+24, ЭК+39 и ЭК+52 методом spFRET-микроскопии. На основании данных многочисленных экспериментов по транскрипции на мононуклеосомных мартицах in vitro были количественно измерены остановки фермента в различных положениях нуклеосомы с использованием пакета программ KinTek Kinetic Explorer, и полученные данные проанализированы. Оказалось, что скорость-лимитирующими стадиями являются этапы прохождения участков +(11-15), +(26-27), +(35-37) и +(45-48) нуклеосомной ДНК. Методами ДНКазного и гидроксильного футпринтинга были изучены структуры двух элонгационных комплексов ЭК+42 и ЭК+49, ключевых интермедиатов транскрипции. Установлено, что в +42 комплексе РНКП и нуклеосома находятся в тесном контакте, причем спейсерная ДНК между ними закрыта белками, и поэтому не доступна для этих реагентов. В остановленном комплексе происходит откат РНКП против хода транскрипции, что вызывает возвращение ДНК на поверхность октамера гистонов и блокировку РНКП в непродуктивном комплексе. В +42 комплексе наблюдается открытая конформация промотор-проксимального участка ДНК +(1-25), то есть в этом ЭК не происходит образования петлевого интермедиата с включенной РНКП. В то же время наблюдается повышение чувствительности двух участков около позиции +100 с сохранением характерного нуклеосомного паттерна футпринтинга. Скорее всего, это свидетельствует в пользу того, что при сохранении связи промотор-дистального участка с октамером происходит изменение конформации нуклеосомной ДНК. По результатам этих исследований опубликована статья в PNAS (2015). В +49 комплексе наблюдается частичная защита промотор-проксимального участка ДНК +(1-15). Таким образом, в нем происходит образование петлевого интермедиата. В то же время наблюдается и частичная потеря защиты промотор-дистального фрагмента +(70-145). Это свидетельствует в пользу того, что часть комплексов находится в состоянии с "отвернутым" промотор-дистальным фрагментом. Так как большинство нуклеосом выживают при транскрипции, можно предположить, что при формировании +49 комплекса в большинстве нуклеосом одновременно не бывает открыт и дистальный, и проксимальный к промотору участки (иначе с высокой вероятностью происходила бы потеря октамера). Это перераспределение контактов может быть принципиальным моментом для прохождения РНКП через нуклеосомный барьер. Сравнительное исследование структур комплексов +42 и +49 позволило существенно улучшить понимание процесса транскрипции нуклеосом (т.н. «нуклеосомного цикла»). Для трех типов флуоресцентно-меченых нуклеосом с проксимальным (Су3 +13; Су5 +91), срединным (Су3 +35; Су5 +113) и дистальным (Су3 +56; Су5 +135) расположением меток были получены элонгационные комплексы, остановленные в положениях +48 и +49 на нуклеосомной ДНК. Они были исследованы методом spFRET-микроскопии в режиме свободной диффузии с построением частотных распределений величины FRET. Анализ полученных данных позволил предположить, что в положениях +48/+49 происходит РНКП-зависимая реорганизация нуклеосомы, при которой промотор-проксимальная часть нуклеосомной ДНК восстанавливает контакты с октамером гистонов, а промотор-дистальная, наоборот, освобождается от них, облегчая дальнейшее прохождение фермента. Различия FRET-сигналов для ЭК в положениях +48 и +49 свидетельствуют о структурных изменениях комплексов РНКП-нуклеосома при движении всего на 1 п.н. Методом электронной томографии и ПЭМ макромолекул получена с разрешением 2,5 нм первая трехмерная структура элонгационного комплекса, остановленного в положении +24 (ЭК+24). В результате анализа изображений и интерпретации трехмерной структуры с помощью докинга кристаллических структур свободной нуклеосомы и РНКП показано, что ЭК+24 имеет гибкое строение, так как полимераза и нуклеосома соединены нуклеосомной ДНК значительной длины. В ходе работы на данном этапе были получены модели отрелаксированных молекулярно-динамических нуклеосом с различной степенью открученности ДНК от гистонового кора, которые необходимы для построения геометрии ДНК на этапе интеграции данных ПЭМ и моделирования. Получены модели конформационных перестроек в нуклеосомах под действием внешних напряжений в неявно заданном растворителе. Созданы модели структурных перестроек нуклеосом в результате потери отдельных димеров гистонов: в частности две модели гексасом, которые могут быть применены для построения атомистических моделей комплексов с РНКП на этапе интеграции данных ПЭМ. Разработан оригинальный алгоритм количественного анализа экспериментальных данных гидроксильного футпринтинга, позволяющий с высокой точностью определять доступность участков ДНК для повреждающих агентов. Разработан алгоритм и методика предсказания профилей гидроксильного футпринтинга по молекулярным моделям нуклеосом и их интермедиатов. Получены теоретические профили футпринтинга, хорошо согласующиеся с экспериментальными данными. На основании методики предсказания профилей расщепления ДНК разработан набор коллективных переменных для проведения управляемой молекулярной динамики для интеграции экспериментальных данных гидроксильного футпринтинга в процесс построения моделей нуклеосом и их комплексов. На основе экспериментальных данных (ЭМ, футпринтинг) создана и опубликована модель элонгационного комплекса в положении +42 (PNAS 2015). В исследованиях иммобилизованных мононуклеосом методом spFRET-TIRF-микроскопии были разработаны полуавтоматические процедуры обработки данных, что существенно облегчило и ускорило анализ проводимых экспериментов. На основе TIRF-микроскопии разработана методика измерений spFRET и анализа конформационных изменений ДНК в составе одиночных иммобилизованных нуклеосом c непрерывным наблюдением за нуклеосомами в течение 2-3 минут и временным разрешением около 100 мс. Установлено, что возрастание ионной силы вызывает значительное увеличение амплитуды временного откручивания ДНК от гистонового кора (амплитуды «дыхания» ДНК) при сохранении исходного типа укладки ДНК в составе нуклеосомы. С помощью отработанных подходов были исследованы методом spFRET-TIRF-микроскопии иммобилизованные ЭК+48 и ЭК+49. Ведется анализ и интерпретация полученных данных с применением методов молекулярного моделирования. На основе анализа описанных выше данных было установлено, что места сильного нуклеосом-специфического паузирования (в участках +15 и +45 относительно промотор-проксимальной границы нуклеосомы) расположены на 10–20 п.н. выше районов I и II сильных ДНК-гистоновых взаимодействий, соответственно. Это дает основание предположить, что отворачивание ДНК от октамера гистонов в указанных областях затруднено, что и приводит к повышенной вероятности задержки транскрипционных комплексов. В ходе наших исследований было установлено, что паузирование РНК-полимеразы II (РНКП2) в районах +15 и +45 только отчасти зависит от последовательности ДНК, что объясняется присутствием сильных, не зависимых от последовательности ДНК-гистоновых взаимодействий в районах I и II. Нами был охарактеризован также район III, влияющий на позиционирование нуклеосомы, общую аффинность ДНК-гистоновых взаимодействий и +45 паузирование, независимое от последовательности ДНК. В целом по нашим данным, сложная последовательность частичных откручиваний/накручиваний ДНК с/на поверхность октамера во многом определяет позиции и силу паузирования фермента при транскрипции нуклеосомы. После остановки РНКП2, ее длительность может варьировать в зависимости от вероятности и степени «отката» РНКП2 по ДНК в направлении, обратном направлению транскрипции. Метод spFRET-микроскопии был впервые применен для изучения структурной организации нуклеосом в комплексах с гистоном Н1 в растворе. Показано, что созданные нами нуклеосомы с флуорофорами, введенными в разные участки линкеров (Cy3 -20; Cy5 +172), (Cy3 -18; Cy5 +166), (Cy3 -15; Cy5 +164), (Cy3 -10; Cy5 +161), являются новым удобным инструментом для изучения образования хроматосом и исследования взаимодействий с ними различных белковых факторов, влияющих на структуру линкеров. Исследования образования комплексов нуклеосом с неполными вариантами гистона Н1 1-127 и 35-120 показало, что вариант 1-127 способен формировать хроматосому, а вариант 35-120 – нет. Выявлены отличия в структуре хроматосом, сформированных вариантом 1-127, от хроматосом, образованных полноразмерным гистоном Н1.5, по конформации ДНК-линкеров. Ведется расшифровка результатов spFRET-анализа в терминах конформации линкеров и положения гистона Н1.5 (и варианта 1-127) в составе хроматосомы. Был написан программный пакет, вычисляющий расстояния между метками по распределению эффективностей FRET и способный, с учетом структуры нуклеосомы и механических свойств молекулы ДНК, построить модель, соответствующую такому распределению. Были получены ДНК-матрицы, содержащие уникально позиционированные разрывы нетранскрибируемой цепи в положениях +12, +17, +22 и +31 на нуклеосом-позиционирующей последовательности. С помощью таких матриц был детально охарактеризован эффект разрывов на транскрипцию. Опыты по транскрипции полученных матричных ДНК выявили качественные отличия в эффективности элонгации РНК-полимеразы через интактные и поврежденные матрицы в случае организации ДНК в нуклеосомы. При транскрипции ДНК таких отличий выявлено не было. В частности, было показано, что разрывы в +12 или +17 положениях вызывают остановку в положении +24, +22 – в +34, а +31 – в +44. По полученным данным опубликована статья в журнале Science Advances 2015. В экспериментах по транскрипции на мононуклеосомной матрице было установлено, что РНКП S.cerevisiae в присутствии гистонового шаперона Asf1 легче преодолевает нуклеосомный барьер в положении+15 и сильнее задерживается в +45 позиции. Полученные данные позволяют предположить, что Asf1 перераспределяет ДНК-гистоновые контакты в нуклеосоме, снижая высоту транскрипционного барьера в ее промотор-проксимальной части и усиливая в +45 области, где по нашим данным образуется петля нулевого размера, играющая важную роль при прохождении РНКП через нуклеосомный барьер. Были проведены эксперименты по транскрипции полинуклеосомных матриц при различных концентрациях ионов магния. Было установлено, что эффективность транскрипции значительно увеличивалась с ростом числа нуклеосом на матрице. Эффект зависел от высокой концентрации ионов магния и наличия N-хвостов коровых гистонов, то есть наблюдался лишь при условиях, способствующих межфибриллярным взаимодействиям. В ходе исследований был обнаружен негативный эффект N-концов гистонов на сохранение нуклеосом в ходе транскрипции. На основании результатов, полученных в ходе работы над проектом совместно с предыдущим данными, была дополнена модель транскрипции РНК-полимеразы II через нуклеосомы. | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Эпигенетические механизмы и регуляция транскрипции:структурно-функциональный анализ и разработка новых методов исследования |
Результаты этапа: На флуоресцентно-меченых ДНК-матрицах с возможностью остановки РНКП в различных положениях собраны мононуклеосомы и методами FRET-анализа изучены открытый комплекс с РНКП, а также различные элонгационные комплексы. Анализ на основе spFRET-микроскопии в растворе был дополнен разработкой и применением в исследованиях оригинальной методики анализа FRET флуоресцентно-меченых нуклеосом и их комплексов с РНК-полимеразой в полиакриламидном геле после электрофореза. Новая методика обеспечивает возможность прямого сравнения данных для различных ЭК, получаемых биохимическими подходами, с данными, получаемыми spFRET-микроскопией. Помимо выявления структурных изменений в различных ЭК, данная методика позволяет оценивать содержание в образце продуктивных и непродуктивных комплексов, динуклеосом и неспецифических комплексов; открывает возможность контролируемой оптимизации условий постановки экспериментов по транскрипции нуклеосом, повышения информативности и достоверности анализа данных spFRET-микроскопии. Методами футпринтинга с использованием ДНКазы I и время-разрешенного гидроксильного футпринтинга определены участки ДНК, проявляющие повышенную и пониженную чувствительность к разрезающим агентам в элонгационном комплексе ЭК(+24), что позволило установить области нуклеосомы, в которых произошли структурные изменения в укладке ДНК при формировании этого комплекса. Методом электронной томографии и ПЭМ макромолекул получены трехмерные структуры элонгационного комплекса, остановленного в положении +24 (ЭК+24) в результате введения одноцепочечного разрыва. В результате анализа изображений и интерпретации трехмерной структуры с помощью докинга кристаллических структур свободной нуклеосомы и РНКП показано, что ЭК+24 с однонитевым разрывом характеризуется образованием внутринуклеосомной петли, которая возникает в результате изменения механических свойств ДНК в результате разрыва. Разработан метод, позволяющий сравнивать результаты экспериментов, полученных методом spFRET с молекулярными моделями комплексов нуклеосом с белками (например, РНКП). Для реализации данного метода были рассчитаны параметры конформационной ориентации флуоресцентных меток относительно сайта посадки на нуклеосоме путем моделирование в явном растворителе. Метод необходим для верификации полученных моделей и опробован на комплексе нуклеосомы с гистоном H1. Разработан и опробован метод управляемой молекулярной динамики, применимый для моделирования комплексов нуклеосом с белками. Метод позволяет интегрировать в процесс моделирования данные spFRET и гидроксильного расщепления ДНК. Данный метод в значительной степени облегчает интерпретацию и визуализацию экспериментальных данных. На основе полученных экспериментальных данных создана модель +24 комплекса РНКП и нуклеосомы. Разработанные методики позволяют рассматривать процессы прохождения транскрипции опираясь на данные, полученные из биохимических исследований, позволяя интерпретировать наблюдаемые эффекты на атомистическом уровне. Данные методы, в комплексе с электронной микроскопией, позволяют восстанавливать структуры интермедиатов, которые недоступны для классических методов структурной биологии. Методом жесткого докинга с использованием структур нуклеосом и элонгационного комплекса дрожжевой РНКП 2 (структуры ПДБ 3LZ0 и 1Y1W, соответственно) построена атомистическая модель ключевого ЭК+49. Используя построенную модель ЭК+49, были идентифицированы три предполагаемые поверхности взаимодействия между РНКП 2 и гистонами в комплексе. На основе предсказаний модели сконструированы и получены мутантные варианты РНКП 2, с помощью которых подтверждены основные выводы, сделанные на основе построенной модели. Были получены и траснкрибированы нуклеосомы 603 (содержащие и не содержащие N-концы гистонов Н2А/Н2В). Удаление N-концов гистонов Н2А/Н2В приводит к более эффективной транскрипции участков +15 и +45 нуклеосомной ДНК, как и предполагалось на основании анализа модели ЭК+49. Методом spFRET с применением нуклеосом, флуоресцентно-меченых в области линкеров по различным положениям была охарактеризована конформация линкерных (межнуклеосомных) участков ДНК в комплексах с вариантом линкерного гистона Н1.5, аминокислотная последовательность которого укорочена до положений 1-177. Установлено, что вариант 1-177 и полноразмерный Н1.5 сходным образом меняют конформацию линкеров в области наиболее близкой к кор-нуклеосоме, значительно сближая их друг с другом. В более удаленных от кор-нуклеосомы областях воздействия 1-177 на конформацию линкеров заметно снижаются по эффективности и качественно меняются по сравнению с Н1.5. При этом отличия во взаимодействиях Н1.5 и 1-177 с линкерами намного меньше, чем различия в случае исследованных ранее укороченных вариантов гистонов 1-127 и 35-120. Построена модель, согласно которой наиболее существенное влияние на конформацию удаленных от кор-нуклеосомы линкерных фрагментов ДНК оказывает С-концевой фрагмент Н1.5. Данные spFRET-микроскопии подтверждают, что глобулярный домен линкерного гистона выполняет в первую очередь функцию позиционирования молекулы этого белка на нуклеосоме, а поликатионный С-концевой фрагмент обусловливает компактизацию межнуклеосомной ДНК. В экспериментах по транскрипции РНКП 2 S.cerevisiae мононуклеосомной матрицы 603 было установлено, что гистоновый шаперон Asf1 увеличивает выход полноразмерных транскриптов и высвобождение нуклеосом без сопутствующей диссоциации нуклеосомной ДНК в ходе транскрипции, снижая барьер для прохождения РНКП через нуклеосому. В присутствии Asf1 фермент легче преодолевает нуклеосомный барьер в положениях +35 и +47 от начала нуклеосомы и не вытесняет нуклеосомы с ДНК во время транскрипции. Предложена модель действия Asf1, предполагающая, что этот белок взаимодействует с временно доступными в нуклеосоме поверхностями октамера гистонов, открывающимися во время транскрипции и, такими образом, нарушает ДНК-гистоновые контакты в нуклеосоме, снижая высоту транскрипционного барьера и способствуя сохранению нуклеосом. При анализе транскрипции in vitro на полинуклеосомных матрицах установлено, что ее эффективность увеличивается с ростом числа нуклеосом и концентрации ионов магния. N-концы коровых гистонов негативно влияли на сохранение нуклеосом в ходе транскрипции, а повышение числа нуклеосом на матрице способствовало их сохранению. Оба H2A/H2B димера высвобождались в ходе транскрипции как длинных, так и коротких матриц со сходной высокой вероятностью. Методом spFRET-микроскопии показано, что дрожжевой белковый комплекс FACT может обратимо и АТФ-независимо раскручивать нуклеосомную ДНК in vitro. Разворачивание происходит симметрично и без потери гистонов, по механизму «все или ничего». Мутантный вариант комплекса FACT, известный в литературе как FACT(Spt16-11), раскручивает нуклеосомы хуже, чем интактный комплекс. Определенные мутации в гистонах, которые компенсируют in vivo мутации в FACT(Spt16-11), также восстанавливают активность шаперона гистонов и in vitro. Сделан вывод, что FACT-опосредованное масштабное разворачивание нуклеосомной ДНК является важной функцией белкового комплекса in vivo. В исследованиях по репликации позиционированных мононуклеосом T7 реплисомой in vitro установлено, что нуклеосомы формируют высокий, сиквенс-специфичный, барьер для репликации, с особенно сильным паузированием ДНК полимеразы в +(31–40) и +(41–65) участках нуклеосомной ДНК. Наличие свободной ДНК облегчает прохождение полимеразы через нуклеосому; после репликации, минимум 50% нуклеосом изменяют свою конформацию, сохраняя свое положение на ДНК. Предложены возможные пути реорганизации хроматина во время/после репликации in vivo. Показано, что расстояния между нуклеосомами, а также присутствие более протяженных участков ДНК, не занятых нуклеосомами, способны как положительно, так и отрицательно модулировать структуру и динамику хроматина, таким образом влияя на скорость энхансер-промоторной коммуникации (ЭПК) in vitro и in silico. Увеличение межнуклеосомного расстояния с 25 до 60 п.н. увеличивает эффективность ЭПК. Наличие же более протяженных участков ДНК, не занятых нуклеосомами, может как положительно, так и отрицательно влиять на скорость ЭПК в зависимости от их длины и положения в фибрилле хроматина. Таким образом, свободные от нуклеосом участки ДНК позволяют дифференциально регулировать эффективность ЭПК, тем самым модулируя экспрессию генов. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".