| 1 |
7 августа 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Выбор направлений исследований. Обзор научной литературы, апробация подходов. |
| Результаты этапа: На этапе № 1 выполнен аналитический обзор 227 (83 -за период 2009 – 2014 гг) информационных источников, включающих информацию об особенностях протекания заболевания, вызываемых патогеном листовой (бурой) ржавчины, распространённости заболевания, эффективности генетической защиты растений, механизмах формирования неспецифической защиты у растений.
На основе анализа литературы обосновано направление исследований (отбор селекционного материала для поиска новых генов, разработка генных сетей формирования специфической и неспецифической устойчивости), выбраны подходы (идентификация ВАС-клонов к районам локализации генов), выработана стратегия проведения работ, выбраны методы и средства для решения поставленных задач (молекулярно-генетическое картирование генов, секвенирование ВАС-клонов).
Согласно выработанной стратегии на промежуточном этапе работы было проведено генотипирование и анализ устойчивости у 82 гибридных линий пшеницы. Показано, что линии, несущие локус QLr.icg-5B, обладают устойчивостью к листовой (бурой) ржавчине. Отобраны эффективные маркеры Xgwm814 и Xgwm1257 для идентификации генов устойчивости.
Для идентификации и анализа первичной структуры генов устойчивости к листовой (бурой ржавчине) Lr15, Lr16, Lr22a, Lr39=41, Lr52, Lr65 отобрано 250 перекрывающихся ВАС-клонов из районов локализации этих генов на хромосомах 2AS, 2BS, 2DS и 5BS, проведено их размножение для дальнейшего анализа методом высокопроизводительного секвенирования.
Для проведения секвенирования были получены препараты ДНК из отобранных 250 ВАС-клонов из ген-содержащих районов хромосом мягкой пшеницы. Создано 25 пулов ДНК, содержащих по десять BAC-клонов в равных пропорциях и проведено дробление 25 пулов ДНК на фрагменты со средней длиной около 900 п.н. Получено 25 библиотек пулов BAC-клонов и проведено определение их нуклеотидной последовательности методом высокопроизводительного секвенирования. Полученный объем данных соответствует 20-и кратному перекрытию каждого BAC-клона.
В соответствии с ГОСТ Р 15.011-96 проведен патентный поиск.
По результатам анализа литературных источников, включающих информацию о транскрипционной активности генов растений, участвующих в защите от фитопатогенов, опубликована статья в российском рецензируемом журнале, цитируемом базой данных SCOPUS.
Все поставленные задачи по промежуточному этапу выполнения работ в рамках договора, выполнены полностью и создан научно-технический задел для успешного выполнения целей и задач последующих этапов.
В работе использовались наиболее современные методы молекулярного и биоинформационного анализа геномов, а также оригинальные методические подходы, разработанные сотрудниками МГУ и НГУ.
Уровень проведенных работ соответствует мировым стандартам. Полученные результаты приоритетны, выполнены на самом высоком методическом уровне и важны для решения многих как научных, так и прикладных задач генетики, селекции, биотехнологии растений и различных смежных областях.
|
| 2 |
1 января 2015 г.-30 июня 2015 г. |
Экспериментальные исследования поставленных перед ПНИ задач. Сборка последовательностей ДНК ВАС-клонов пшеницы. |
| Результаты этапа: На этапе № 2 был проведен анализ нуклеотидных последовательностей, полученных при секвенировании 250 ВАС клонов и сборка их в контиги. В результате секвенирования 250 BAC клонов было получено около 1.129 млрд нуклеотидов. Общая длина секвенированных последовательностей после фильтрования составила 859,4 млн. нуклеотидов. Это составило в среднем 45-x кратное покрытие ВАС-клонов. В результате сборки последовательностей 250 BAC клонов средний размер контига для каждого клона составил 8835 нт.
1. Проведен расширенный поиск данных по генам устойчивости к грибным патогенам пшеницы и других изученных видов растений, родственных пшенице. Проанализированы данные по 9 основным локусам устойчивости у злаков, представленные в генбанках.
2. По данным секвенирования ВАС-клонов разработано 175 SSR и SNP маркеров.SSR-маркеры охватывали все пулы секвенированных ВАС-клонов и локализовались в ген-богатых участках, SNP-маркеры разрабатывались на различные аллельные варианты генов устойчивости.
3. Проведен анализ литературных данных по поиску молекулярных маркеров, сцепленных с идентифицированными генами устойчивости к листовой ржавчине и отобраны молекулярные маркеры, которые будут использованы на третьем этапе работы для оценки генетического разнообразия гибридных линий и сортов пшеницы по генам устойчивости к листовой ржавчине
Все поставленные задачи по промежуточному этапу выполнения работ в рамках договора, выполнены полностью и создан научно-технический задел для успешного выполнения целей и задач последующих этапов.
В работе использовались наиболее современные методы молекулярного и биоинформационного анализа геномов, а также оригинальные методические подходы, разработанные сотрудниками МГУ и НГУ.
Уровень проведенных работ соответствует мировым стандартам. Полученные результаты приоритетны, выполнены на самом высоком методическом уровне и важны для решения многих как научных, так и прикладных задач генетики, селекции, биотехнологии растений и различных смежных областях. |
| 3 |
1 июня 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Экспериментальные исследования поставленных перед ПНИ задач. Идентификация генов устойчивости в нуклеотидных последовательностях контигов и их анализ. |
| Результаты этапа: 1. На этапе 3 с использованием биоинформационных методов проведен анализ последовательностей 52 контигов, полученных в результате секвенирования ВАС-клонов пшеницы. Был разработан биоинформационный алгоритм идентификации NBS-LRR генов пшеницы. Проведенный анализ 41 млн нуклеотидов позволил выявить 5109 генов, включая последовательности 21 нового гена устойчивости пшеницы. Для идентифицированных генов устойчивости была определена их структура и тип R-генов, определены и охарактеризованы основные домены и мотивы.
2.Создана база данных генов устойчивости к фитопатогенам, состоящая из трех таблиц (гены, аллели, нуклеотидные последовательности) и содержащая 111 уникальных записей (карточек).
3. На выборке из 30 сортов и линий пшеницы различного происхождения проведено тестирование 18 SSR-маркеров. Показано, что все тестируемые сорта и линии, кроме Chinese Spring, характеризуются устойчивостью к расам бурой ржавчины Западно-Сибирского региона. Были выявлены 4 SSR-маркера, выявляющие высокий уровень полиморфизма у сортов, устойчивых к бурой ржавчине и неустойчивого сорта Chinese Spring
4. Проведена оценка генетического разнообразия 50 гибридных линий и сортов пшеницы по генам устойчивости к листовой ржавчине. Показано, что большая часть из них защищена комбинацией генов Lr1, Lr10, Lr19. Показано, что в сортообразцах отсутствуют гены Lr25, Lr28 и Lr29 - эффективные гены устойчивости против патотипов западносибирской популяции листовой ржавчины, что позволяет рекомендовать включение этих генов в селекционные программы |
| 4 |
1 января 2016 г.-30 июня 2016 г. |
Экспериментальные исследования поставленных перед ПНИ задач. Идентификация генов устойчивости к листовой ржавчине и разработка генной сети формирования ответа на инфекцию, вызванную патогенными грибами |
| Результаты этапа: 1.Проведено секвенирование 250 ВАС-клонов (№251-500) мягкой пшеницы.
2.Проведена сборка нуклеотидных последовательностей, полученных при секвенировании 250 ВАС клонов (№251-500) в контиги, были идентифицированы гены и предсказана их функция.
3.Разработана генная сеть формирования ответа на инфекцию, вызванную патогенными грибами.
4.Разработана лабораторная методика генотипирования растений с использованием молекулярных маркеров для генов, определяющих устойчивость к листовой ржавчине.
|
| 5 |
1 июля 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Обобщение и оценка полученных результатов |
| Результаты этапа: В ходе выполнения проекта проведено секвенирование 500 ВАС-клонов из ген-содержащих районов хромосом мягкой пшеницы. Общая длина определенных последовательностей после фильтрования составила 2,113 млрд нуклеотидов, кратность прочтения составила 42Х. В результате сборки последовательностей 500 BAC-клонов средний размер контига для каждого клона составил 8169 нт.
В результате проведенного биоинформационного анализа последовательностей 52 контигов пшеницы было de novo идентифицировано 4762 гена, из которых 363 гена с содержательным описанием (без ретровирусов, транспозонов и митохондриальных генов), имеющие гомологию с генами растений с известной функцией. Были выявлены и охарактеризованы последовательности 21 нового гена устойчивости пшеницы, в том числе было идентифицировано 3 новых гена пшеницы, высоко гомологичных известным Lr-генам устойчивости к листовой ржавчине.
По данным секвенирования ВАС-клонов разработано 175 SSR- и SNP-маркеров. SSR-маркеры охватывали все пулы секвенированных ВАС-клонов и локализовались в ген-богатых участках, SNP-маркеры разрабатывались на различные аллельные варианты генов устойчивости.
Создана база данных генов устойчивости к фитопатогенам, состоящая из трех таблиц (гены, аллели, нуклеотидные последовательности) и содержащая 111 уникальных записей (карточек). Разработана генная сеть формирования ответа на инфекцию, вызванную патогенными грибами. Используя технологию GenNet, были представлены регуляторные взаимодействия между генами защитного ответа у пшениц во время инфицирования патогенными грибами. На выборке из 30 сортов и линий пшеницы различного происхождения проведено тестирование 18 SSR-маркеров. Показано, что все тестируемые сорта и линии, кроме Chinese Spring, характеризуются устойчивостью к расам бурой ржавчины Западно-Сибирского региона. Проведена оценка генетического разнообразия 50 гибридных линий и сортов пшеницы по генам устойчивости к листовой ржавчине. Показано, что большая часть из них защищена комбинацией генов Lr1, Lr10, Lr19. Показано, что в сортообразцах отсутствуют гены Lr25, Lr28 и Lr29 - эффективные гены устойчивости против патотипов западносибирской популяции листовой ржавчины, что позволяет рекомендовать включение этих генов в селекционные программы.
На основе биоинформатических и молекулярно-генетических подходов были разработаны методики идентификации генов устойчивости к листовой ржавчине, а также лабораторная методика генотипирования растений с использованием 13 специфических маркеров к генам устойчивости к листовой ржавчине. Проведена оценка полученных молекулярных маркеров Lr-генов, обуславливающих устойчивость к листовой ржавчине, путем сопоставления данных полевой оценки образцов и результатов молекулярного маркирования сортов яровой мягкой пшеницы сибирской коллекции. Показано, что маркеры обеспечивают надежную идентификацию Lr –генов устойчивости (амплификация не менее 90%).
Были разработаны методические рекомендации по использованию маркеров для создания и отбора устойчивых к листовой ржавчине линий пшеницы, а также рекомендации и предложения по использованию результатов проведенных ПНИ в реальном секторе экономики.
Был разработан проект ТЗ на ОТР по теме: «Использование маркер-ориентированного отбора для создания сортов устойчивых к листовой ржавчине».
|
