Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислотНИР

Creating a new class of regulators of nucleic acid binding protein activity as the potential biomedical products based on modified nucleic acids

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: В рамках разработки новых ингибиторов интегразы (ИН) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) проведено исследование механизма ингибирования интеграции производными метиленбисфосфонатов (МБФ), содержащими хлорбензильный заместитель при атоме углерода в РСР-участке. Из всех исследованных соединений только α-амино МБФ оказались неконкурентными ингибиторами ИН и, следовательно, могут представлять интерес как потенциальные ингибиторы ИН в прединтеграционном комплексе. Для оценки влияния мутаций лекарственной устойчивости на активность интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A, доминирующего на территории России, получены и охарактеризованы препараты консенсусной интегразы этого субтипа вируса, содержащие первичные мутации лекарственной устойчивости G118R и Q148K и вторичные компенсаторные замены E138K и G140S, и проведено их сравнение с соответствующими мутантными формами интегразы ВИЧ-1 субтипа В штамма HXB-2. Мутация Q148K практически одинаково снижала активность интеграз обоих субтипов. Ее негативный эффект частично компенсировался вторичными мутациями E138K и G140S. Первичная замена G118R оказывала разное влияние на активность белков субтипов А и В, компенсаторное действие вторичной замены Е138К также зависело от субтипа вируса. Сравнение устойчивости всех полученных мутантов к известным ингибиторам переноса цепи ралтегравиру и элвитегравиру и новому ингибитору XZ-259 из класса дигидро-1Н-изоиндолов показало, что белки обоих субтипов с мутацией Q148K мало чувствительны к ралтегравиру и элвитегравиру, но достаточно эффективно ингибируются XZ-259. Замена G118R незначительно снижала эффективность ингибирования интеграз ралтегравиром и элвитегравиром и не вызывала устойчивости к XZ_259. В рамках исследования свойств и функций малых некодирующих РНК впервые было показано, что 6S-1 и 6S-2 РНК Bacillus subtilis способны специфически ингибировать in vitro транскрипцию модельных промоторов различных генов B. subtilis. Установлено, что обе 6S РНК проявляют сравнимую эффективность ингибирования транскрипции вне зависимости от нуклеотидных последовательностей промоторных элементов выбранных генов и природы стартового нуклеотида. Впервые продемонстрирован in vitro синтез коротких фрагментов РНК (пРНК) на 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis в качестве матриц для транскрипции и определены их нуклеотидные последовательности. Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) изучена морфология агрегатов, образуемых сигма70-субъединицей РНК-полимеразы E.coli и ее мутантными вариантами в различных условиях, при варьировании ионной силы и рН раствора, а также в присутствии различных низкомолекулярных лигандов. Обнаруженный полиморфизм агрегатов позволил предложить новую универсальную модель формирования амилоидных фибрилл. Методом молекулярного клонирования и сайт-специфического мутагенеза в комбинации с аффинной хроматографией получен рекомбинантный белок ядерного экспорта вируса гриппа (NEP), а также ряд мутантных вариантов белка с заменами остатка триптофана 78, предположительно участвующего во взаимодействии с белком оболочки вируса М1. Продемонстрирована высокая способность белка к агрегации. Методами светорассеяния и атомно-силовой микроскопии изучена морфология образующихся агрегатов, представляющих собой в основном сферические макрочастицы. Исследовано влияние различных факторов (ионной силы, концентрации белка, присутствие различных низкомолекулярных лигандов) на характер агрегации.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: На примере никующей эндонуклеазы BspD6I разработан подход, позволяющий регулировать активность фермента в заданный момент времени с помощью внешнего сигнала (изменение температуры) за счет использования термочувствительных аналогов субстрата. Сконструированы 13- и 15-звенные немодифицированные синтетические ДНК-дуплексы, которые блокируют активность фермента при 20 °С. Повышение температуры вызывает диссоциацию дуплексов-ингибиторов и приводит к восстановлению ферментативной активности. Предлагаемый подход может быть использован для оптимизации реакции изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи, а также для модулирования активности химерных нуклеаз, применяемых в генной терапии. В рамках разработки новых ингибиторов репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) проводится изучение молекулярных и структурных особенностей взаимодействия интегразы вирусной (ИН) и клеточного белка Ku70. Предполагается, что взаимодействие Ku70с ИН важно для эффективной репликации ВИЧ-1, поэтому комплекс этого клеточного белка с вирусной ИН может рассматриваться в качестве новой мишени для создания противовирусных препаратов. Установлено, что Ku70 связывается с ИН ВИЧ-1; причем это взаимодействие специфично, поскольку с ИН другого ретровируса (PFV) Ku70 не связывается. С помощью специально полученных делеционных мутантов обоих белков показано, что N-концевой домен Ku70 связывается с каталитическим доменом ИН в районе аминокислот 160-220. Взаимодействие С-концевого домена Ku70 с интегразой происходит в районе аминокислот 50-160. Более детальное изучение участков связывания будет продолжено. Методом сайт-специфического мутагенеза в комбинации с аффинной хроматографией получен ряд мутантных вариантов белка Е2 (одного из основных компонентов вириона вируса гепатита C) с заменами аминокислотных остатков в сайтах N-гликозилирования. Исследование влияния произведенных замен на взаимодействие Е2 с белком Е1 в бакуловирусной системе позволило выявить ключевые сайты, участвующие в образовании функционального гетеродимерного комплекса Е1-Е2, обеспечивающего полноценную сборку вирусной частицы. С целью изучения механизмов агрегации белков методами генной инженерии получен набор плазмидных конструкций, позволивших экспрессировать и выделить в чистом виде ряд мутантных вариантов белка ядерного экспорта вируса гриппа (NEP), в том числе составных белков, содержащих флуоресцентные компоненты. Исследование методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) морфологии агрегатов, формируемых некоторыми рекомбинантными белками, позволило предложить усовершенствованную модель формирования амилоидных фибрилл.
4 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: Объектом изучения на данном этапе исследования являлись никующие эндонуклеазы (НЭ) – ферменты, вносящие разрыв только в одну из цепей ДНК. Такие НЭ, как правило, являются одной из субъединиц гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции. Целью работы являлось получение новой информации о функционировании гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции, одна из субъединиц которых является НЭ (на примере эндонуклеазы рестрикции BspD6I), а также модулирование активности фермента для расширения границ их практического использования. Продемонстрировано взаимовлияние большой и малой субъединиц эндонуклеазы рестрикции BspD6I на функционирование друг друга. Показано, что начальная скорость гидролиза ДНК-субстрата большой субъединицей в присутствии малой субъединицы в 2 раза выше. Установлено, что катализ гидролиза двух цепей ДНК эндонуклеазой рестрикции BspD6I происходит, когда обе ее субъединицы находятся в составе одного фермент-субстратного комплекса, вместе с тем малая субъединица может расщеплять ДНК уже после того, как большая субъединица «разрезала» свою цепь. Установлено, что большая субъединица эндонуклеазы рестрикции BspD6I (никующая эндонуклеаза) индуцирует изгиб ДНК при связывании с субстратом. Угол изгиба ДНК составляет 66 ± 4°. Впервые обнаружено влияние ненуклеозидной вставки, содержащей остаток азобензола и находящейся в различных положениях ДНК-лиганда, на функционирование эндонуклеазы рестрикции BspD6I. Каталитическая активность большой субъединицы при этом не является единственно необходимым фактором для проявления активности малой субъединицы. Большая субъединица сближена с участками гидролиза ДНК малой субъединицей BspD6I, обеспечивая её локализацию на ДНК. В качестве ингибиторов активности большой субъединицы ЭР BspD6I при 25°С предложено использовать ДНК-лиганды с модифицированным межнуклеотидным узлом в месте гидролиза и одноцепочечными разрывами. Повышение температуры реакционной смеси до 45°С приводит к диссоциации дуплексов-ингибиторов, высвобождению фермента и восстановлению его активности.
5 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: В ходе проведенных исследований, применяя для ДНК с G-мотивом комплексообразование с белком MutS в присутствии АТФγS, определяя долю исследуемой ДНК в комплексе при определенной концентрации MutS и сравнивая с долей связанной ДНК с петлей, возможно определить формирование G-квадруплексов в системе, где мотив фланкирован двуцепочечными спиралями. В настоящей работе были получены свидетельства о формировании G4 в ДНК-системе, которую не удалось изучить на образование G-квадруплекса другими методами (КД-спектрометрия и УФ-плавление). Таким образом, данный подход имеет преимущество в определении G4 в протяженных ДНК-фрагментах, что может получить развитие в детектировании G-квадруплексов, например, в плазмидных ДНК. Впервые исследовано связывание белка MutS с ДНК-дуплексом с одним внутримоле-кулярным G-квадруплексом. Охарактеризовано значениями Kd сродство различных ДНК-лигандов к белку MutS из E. coli в присутствии различных кофакторов (АДФ, АТФ и АТФγS). Показана наибольшая эффективность связывания MutS с ДНК, содер-жащей G-квадруплекс, что наиболее ярко выражено в присутствии АТФγS. Предло-жен подход для определения формирования G-квадруплекса в ДНК-системах, где G4-мотив фланкирован с обеих сторон двойными спиралями, на основании значений Kd для комплексообразования в присутствии АТФγS. Обнаружено ограничение на длину фланкирующих участков, связанное с дестабилизацией дуплекса.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: Современные методы борьбы с вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) предполагают разработку новых терапевтических препаратов. Актуальным является поиск новых мишеней для создания препаратов с минимальным риском развития резистентности. Такими мишенями потенциально могут быть комплексы вирусных белков с клеточными белками, участвующими в репликации вируса. Была поставлена задача - изучение структурных основ взаимодействия интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku-70, подавление экспрессии которого в культуре клеток приводит к снижению эффективности репликации вируса. Впервые показано, что интеграза ВИЧ-1 (ИН) и клеточный белок Ku70 формируют устойчивый комплекс in vitro. Определены структурные элементы интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70, необходимые для образования комплекса между ними. Обнаружено соединение, препятствующее взаимодействию ИН ВИЧ-1 с Ku70, - конъюгат эозина с 2’-О-метилолигонуклеотидом, охарактеризован механизм ингибирования. Разработан метод, позволяющий количественно определять степень репарации геномной ДНК после интеграции в нее вирусной ДНК. С использованием этого метода впервые достоверно показано, что Ku70 в составе ДНК-зависимой протеинкиназы DNA-PK участвует в постинтеграционной репарации ДНК. Полученные результаты способствуют пониманию механизмов постинтеграционной репарации ДНК, а также могут быть использованы для создания принципиально новых препаратов, подавляющих репликацию ВИЧ-1.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: Система репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (Mismatch repair system, MMR) является основным способом восстановления структуры ДНК, что необходимо для поддержания стабильности генома. Система MMR наиболее известна прежде всего своей ролью в исправлении «ошибок» биосинтеза ДНК, которые возникают в реплицируемой цепи ДНК. «Ошибки» заключаются в появлении некомплементарных пар оснований или в образовании дополнительных нуклеотидов, инсерционных или делеционных петель, особенно часто наблюдаемых в повторяющихся последовательностях. Система MMR также связана с узнаванием модифицированных оснований, возникающих в ответ на эндогенные и экзогенные факторы, разрушающие ДНК, такие как активные формы кислорода, образующиеся в ходе транспорта электронов в митохондриях и хлоропластах, алкилирующие вещества и УФ-облучение, которое может привести к аресту клеточного цикла и апоптозу. Целью настоящего этапа работы являлось изучение влияния факторов окружающей среды на функционирование системы репарации «мисматчей» ДНК в клетках Rhodobacter sphaeroides и Escherichia coli. Оценена относительная эффективность транскрипции генов белков МutS и МutL системы репарации неканонических пар нуклеотидов («мисматчей») методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Впервые установлено, что в бактерии R. sphaeroides относительное количество мРНК гена mutS в 20 раз выше, чем mutL, в то время как клетках E. coli относительное количество мРНК гена mutS в 3 раза ниже, чем mutL. Показано, что отсутствие в клетках R. sphaeroides и E. coli глобального регулятора транскрипции генов — 6S РНК не влияет на эффективность транскрипции генов белков MutS и MutL. Установлено, что воздействие различных стрессовых условий на клетки R. sphaeroides и E. coli приводит к уменьшению относительного количества мРНК генов mutS и mutL в 1,5-2,5 раза.
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: Основная проблема современной терапии ВИЧ-инфекции - появление устойчивых к лекарствам штаммов вируса, что приводит к необходимости постоянной смены препаратов. Одним из наиболее перспективных подходов к созданию соединений, которые не вызывают появления резистентных штаммов ВИЧ-1 и/или обладают ингибирующей активностью в отношении них, является подход, основанный на подавлении взаимодействия вирусных белков с клеточными белками, необходимыми для успешной репликации вируса. Это подход еще мало разработан в основном из-за недостаточного знания механизмов взаимодействия вирусных и клеточных белков. Нами установлено, что вирусный фермент интеграза (ИН), который катализирует наиболее важный этап жизненного цикла ВИЧ-1 - интеграцию ДНК-копии вирусного генома в геном инфицированной клетки - взаимодействует с белком Ku70 человека, и это взаимодействие чрезвычайно важно для успешной репарации повреждений клеточного генома, возникающих в результате интеграции. Соответственно, комплекс вирусной ИН и белка Ku70 может рассматриваться в качестве новой мишени для создания анти-ВИЧ препаратов. За отчетный период мы проводили работы по выяснению характера взаимодействия этих белков. Ранее мы показали, что аминокислоты E212 и L213 в составе α6-спирали ИН важны для связывания с Ku70, теперь мы определили район в составе Ku70, который вовлечен в связывание интегразы ВИЧ-1, и показали, что замены аминокислот Ku70_S69A/I72A и Ku70_S73A/I76A приводят к существенному снижению аффинности Ku70 к ИН. Для поиска ингибиторов взаимодействия этих белков разработан подход, основанный на использовании генетически закодированных флуоресцентных белков, присоединенных к ИН и Ku70. Проверка взаимодействия полученных гибридных белков His6-Ku70-tRFP и GST-mCer-ИН методом Вестерн-блоттинга показала, что устойчивость образуемого ими комплекса сравнима с устойчивостью комплекса исходных ИН и Ku70. Разработанный подход к скринингу ингибиторов может быть реализован не только в классическом варианте, в пробирке, с последующим анализом флуоресценции в геле, но и в высокопроизводительном плашечном формате. Белок Ku70 входит в состав гетеродимера Ku, наиболее изученной функцией которого в клетке является репарация двуцепочечных разрывов в ДНК по механизму негомологичного соединения концов. Гетеродимер Ku связывается с возникающим в результате разрыва концом ДНК и привлекает каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеин киназы (DNA-PKcs), формируя полноразмерный фермент ДНК-зависимую протеин киназу (DNA-PK), которая фосфорилирует факторы, необходимые для репарации и запускает этот процесс. Однако, при интеграции вирусной ДНК в геном клетки двуцепочечных разрывов не возникает, а образуются одноцепочечные бреши, фланкирующие вновь интегрированную ДНК вируса, а также неспаренные динуклеотиды CA на 5’-концах вирусной ДНК. Тем не менее, по нашим данным, каталитическая активность DNA-PK необходима для успешной пост-интеграционной репарации ДНК. С целью выяснить, каким образом DNA-PK может участвовать в репарации повреждений, возникающих в геноме после интеграции в него вирусной ДНК, на базе генома ВИЧ-1 получен набор генетических конструкций для продукции однораундных псевдовирусов, содержащих мутации в составе ИН, которые нарушают один из ранних этапов репликативного цикла ВИЧ-1. Определены временные интервалы протекания всех ранних этапов репликации ВИЧ-1 и установлено, что активация DNA-PKcs начинается синхронно с интеграцией вирусной ДНК. Таким образом, процесс пост-интеграционной репарации запускается сразу после появления интеграционного интермедиата с повреждениями в ДНК. На основании этих экспериментов сделан вывод, что DNA-PK участвует в пост-интеграционной репарации по пути, отличному от пути негомологичного объединения концов. Важность этой работы обусловлена тем, что понимание детального механизма пост-интеграционной репарации ВИЧ-1 будет в дальнейшем способствовать созданию новых анти-ВИЧ препаратов со сниженным риском развития резистентности.
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: Работа посвящена изучению свойств белка MutL из организма Neisseria gonorrhoeae (ngMutL), одного из ключевых ферментов системы репарации «мисматчей» (MMR) бактерии. N. gonorrhoeae является патогеном человека и использует различные способы, чтобы адаптироваться к условиям в клетках организма-хозяина, в том числе эффективную репарацию повреждений ДНК. Фундаментальное исследование механизма реализации MMR бактерии является актуальным направлением с точки зрения разработки новых лекарственных препаратов, направленных на регуляцию активности белков системы репарации. Объектами исследования являлись белки MutL из N. gonorrhoeae дикого типа (ngMutLwt) и его бесцистеиновая мутантная форма (ngMutLcf). Цель работы - детальная сравнительная характеристика основных функций ngMutLwt и ngMutLcf: АТФазной, ДНК-связывающей и эндонуклеазной для установления роли Cys в функционировании фермента. Впервые выделены белки ngMutLwt и ngMutLcf, количественно охарактеризованы их АТФазная и ДНК-связывающая активности. Установлено, что остатки Cys напрямую не вовлечены в катализ гидролиза цепи ДНК, поэтому ngMutLcf потенциально может быть основой для создания мутантных форм белка с единственным остатком цистеина в заданном положении полипептидной цепи для последующих исследований. Впервые показано, что ngMutL является β-«зажим»-зависимой эндонуклеазой. Выдвинуто предположение о влиянии замен остатков Cys на формирование белок-белкового взаимодействия между ngMutL и β-«зажимом»
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: Участие клеточного белка Ku в репликации ВИЧ-1 было показано в нескольких работах, однако стадию жизненного цикла вируса, на которую он влияет, долгое время не удавалось установить. Несколько лет назад нами было достоверно показано, что Ku участвует в репарации повреждений ДНК, возникающих в процессе интеграции вирусной ДНК в клеточный геном. Причем в этой пост-интеграционной репарации Ku участвует в составе холофермента DNA-PK (ДНК-зависимая протеинкиназа), основной функцией которого в клетке является репарации двуцепочечных разрывов ДНК по пути негомологичного соединения концов (NHEJ). Транскрипция с вирусного промотора начинается только после успешной пост-интеграционной репарации. Нам было необходимо выяснить, принимает ли Ku участие и в этом процессе. За отчетный период впервые проведено систематическое исследование влияния каждой из субъединиц Ku (Ku70 и Ku80), а также каталитической субъединицы DNA-PKcs на уровень транскрипции с промотора ВИЧ-1. На репортерной системе и на уже интегрированном провирусе показано, что гетеродимер Ku является положительным фактором транскрипции, а каталитическая субъединица DNA-PKcs не влияет на экспрессию с промотора ВИЧ-1. Впервые обнаружено привлечение гетеродимера Ku к промотору ВИЧ-1 на плазмидном векторе и на уже интегрированном провирусе. Впервые установлено, что Ku важен для стадии инициации транскрипции. Проведено исследование РНК-связывающих свойств гетеродимера Ku человека. Показано, что Ku предпочтительно взаимодействует со шпилечными РНК, содержащими выпетливание около G-богатой терминальной петли шпильки. Показано, что РНК связывается с Ku в его ДНК-связывающем сайте. Кроме того, впервые in vitro и в клеточной культуре обнаружено взаимодействие Ku с 7SK РНК – важным регулятором транскрипции ВИЧ-1. Показано, что Ku предпочтительно взаимодействует с первой консервативной шпилькой 7SK РНК. Обнаружено, что Ku взаимодействует с белками комплекса 7SK мяРНП: HEXIM1 и Cdk9, и, возможно, именно это взаимодействие определяет привлечение Ku на промотор ВИЧ-1.
11 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Создание нового класса регуляторов активности белков нуклеинового обмена – потенциальных биомедицинских препаратов на основе модифицированных нуклеиновых кислот
Результаты этапа: Целью работы являлось изучение взаимодействия фермента APE1 системы эксцизионной репарации оснований человека (BER) с модельными фрагментами промотора hTERT, включающими замены G > F (F — стабильный циклический аналог AP-сайта, 1,2-дидезоксирибоза) и C > F в соответствующих «драйверным» мутациям положениям. Основной задачей работы являлось выявление влияния положения модификаций на гидролитическую и ДНК-связывающую активность APE1 в различных условиях. Методом спектроскопии кругового дихроизма была обнаружена различная степень дестабилизации G4 в зависимости от положения модификации в последовательности модельных фрагментов hTERT, что повлияло на эффективность их гидролиза белком APE1 в условиях, способствующих образованию квадруплексной структуры. Показано, что возникновение AP-сайтов в позиции -124 G-богатой и позициях -146, -138/139 С-богатой цепи hTERT значительно затрудняет функционирование APE1 человека. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что закрепление мутаций в последовательности промотора гена hTERT, возможно, является результатом сниженной эффективности работы ферментов системы BER.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. project_report_gost_Gottikh.pdf project_report_gost_Gottikh.pdf 38,0 КБ 19 декабря 2022 [earomanova]
2. Отчет по ГОСТ 2020 project_report_gost.pdf 55,3 КБ 18 декабря 2020 [oretskaya]