Механизм инициации трансляции у млекопитающих, использующий Death Associated Protein 5 (DAP5)НИР

Соисполнители НИР

МГУ имени М.В. Ломоносова Координатор

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 10 января 2014 г.-30 декабря 2014 г. Механизм инициации трансляции у млекопитающих, использующий Death Associated Protein 5 (DAP5)
Результаты этапа: Проект направлен на установление функции фактора трансляции eIF4G2, или DAP5 (Death Associated Protein 5), который похож на eIF4G1, субъединицу универсального фактора eIF4F, рекрутирующего мРНК на 40S субчастицу рибосом у всех эукариот, но в отличие от eIF4G1 DAP5 не имеет участков связывания кеп-связывающей субъединицы и поли(А) связывающего белка (PABP), а следовательно не способен работать в канонической кеп-зависимой инициации трансляции. Вероятно, DAP5 обслуживает какой-то особый класс мРНК, но механизм его работы и вопрос о том, какие это мРНК остается неизвестным. В отчетном году были полностью разработаны подходы, которые должны позволить идентифицировать мРНК, трансляция которых зависит от наличия фактора DAP5. Первый метод основан на введении в геном клеток лентивирусного вектора, несущий последовательность для siRNA против DAP5 под контролем индуцибельного промотера, так что образование siRNA можно регулировать, то включать, то выключать. Идея заключается в том, чтобы подавлять экспрессию DAP5 в клетках млекопитающих и затем смотреть с помощью метода рибосомного профайлинга трансляция каких мРНК при этом изменяется . Получено 4 линии клеток HEK293T с возможностью индукции 4-х различных siRNA, то есть к 4-м разным участкам мРНК DAP5. В настоящее время готовятся кДНК библиотеки для рибосомного профайлинга из клеток с подавленным DAP5 и из контрольных клеток. Другой подход это метод PAR-CLIP. При этом подходе клетки выращивают на среде с тиоуридином, который включается в состав разных мРНК клетки. Клетки затем облучают при 360 нм, что приводит к пришивкам мРНК-связывающих белков к мРНК. Клетки разрушают и РНК, пришитые к исследуемому белку, “вытаскивают” с помощью иммунопреципитации. Далее после очистки РНК превращают в кДНК и секвенируют на аппаратах для глубокого секвенирования. Один подобный опыт был проведен, включая стадию сиквенирования. Но полученные данные требуют подтверждения и о них докладывать пока преждевременно. Материал для повторных опытов уже подготовлен. Наконец, проводится подготовка препаратов, включая препарат самого белка DAP5, для проведения опытов в специальной бесклеточной системе, в которой исходно DAP5 присутствует в очень низких концентрациях.
2 12 января 2015 г.-30 декабря 2015 г. Идентификация мРНК, трансляция которых зависит от DAP5
Результаты этапа: Идентифицированы 23 мРНК из клеток 293Т, трансляция которых падает при нокдауне белка DAP5 с помощью РНК-интерференции. Получен активный рекомбинантный белок DAP5 (eIF4G2)и определено его влияние на разные мРНК в бесклеточной системе из асцитных клеток.
3 1 января 2016 г.-30 декабря 2016 г. Сборка инициирующих комплексов на мРНК, трансляция которых зависит от DAP5
Результаты этапа: В результате работ, выполненных в 2016 году, было выяснено, что DAP5 находится в центре пока еще до конца не выясненного механизма, который играет огромную роль в жизненно важных процессах живой клетки. Нам удалось получить методом CRISPR-CAS9 клон клеток мыши NIH3T3 c нокаутом по этому белку. Получен, к сожалению, пока всего один клон, клетки после нокаута очень трудно выживали и в конечном счете выжил только один. Для этого единственного клона был сделан рибосомный профайлинг, который показал множество существенных изменений, в основном на уровне транскрипции. В результате нокаута всего по одному из малоизученных факторов трансляции, содержание мРНК для целого ряда существенных генов довольно резко упало. Трансляционная эффективность при этом изменилась не значительно. Мы полагаем, что многие мРНК из-за отсутствия DAP5 плохо программируются рибосомами и деградируют. Также не исключено, что первоначально, то есть на первых этапах после нокаута DAP5 произошли существенные изменения в экспрессии транскриптома, возможно из-за низкого синтеза DAP-зависимых транскрипционных факторов, что в свою очередь привело к существенному сдвигу в составе транскриптома клетки. Таким образом, полученный клон клеток с нокаутом по DAP5 скорее всего отражает уже поздние события, произошедшие в ходе культивирования и адаптации клеток.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".