![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
В 2024-2026 гг. предполагается исследование молекулярных механизмов переноса зарядов в пигмент-белковых комплексах фотосистем 1 и 2 цианобактерий и зеленых растений. Планируется изучение влияния конформационной подвижности белков на кинетику переноса электронов в фотосинтетических реакционных центрах. Предполагается исследование влияния температуры и осмолитов на перенос зарядов в электрон-транспортной цепи фотосистемы 1. Планируется исследование кинетики первичных стадий переноса зарядов в реакционных центрах первого и второго типа с помощью фемтосекундной лазерной спектроскопии методом возбуждение-зондирование при низкой температуре в субнаносекундном временном диапазоне. Предполагается изучение взаимодействия комплексов фотосистем 1 и 2 с экзогенными донорами и акцепторами электронов Работа посвящена выяснению важнейших принципов преобразования энергии света при фотосинтезе у растений, цианобактерий и фотосинтезирующих бактерий. Определена природа первичных и вторичных доноров и акцепторов электронов в ФС 1 и 2, а также в бактериальных РЦ. Выявлены факторы, определяющие асимметричный перенос электрона в ФС 1 и 2. Определены кинетика и спектры первичной и вторичной ион-радикальных пар в ФС 1 и 2. С помощью фемтосекундной лазерной спектроскопии с временным разрешением 20 фс показано, что первичное разделение зарядов в РЦ ФС 1 происходит с рекордно высокой скоростью, короче 100 фс. На основании электростатических и квантово-механических расчетов, а также структуры и диэлектрических свойств белка определены редокс-потенциалы всех кофакторов переноса электронов в ФС 1. С помощью суперкомпьютера МГУ построена молекулярно-динамическая модель ФС 1 в нейтральном состоянии и в состоянии с разделенными зарядами. Определена энергия реорганизации первичных процессов переноса электрона.
In 2024 - 2026 it is planned to study the molecular mechanisms of charge transfer in the pigment-protein complexes of photosystems 1 and 2 of cyanobacteria and green plants. It is planned to study the effect of conformational mobility of proteins on the kinetics of electron transfer in photosynthetic reaction centers. It is planned to study the effect of temperature and osmolytes on charge transfer in the electron transport chain of photosystem 1. It is planned to study the kinetics of the primary stages of charge transfer in the reaction centers of the first and second types using femtosecond laser spectroscopy by excitation-probe at low temperature in the subnanosecond time range. It is planned to study the interaction of complexes of photosystems 1 and 2 with exogenous electron donors and acceptors This project is dedicated to elucidating the most important principles of the conversion of light energy during photosynthesis in plants, cyanobacteria and photosynthetic bacteria. The nature of primary and secondary electron donors and acceptors was determined in PS 1 and 2, as well as in bacterial RCs. The factors that determine the asymmetric electron transfer in PS 1 and 2 are revealed. The kinetics and spectra of the primary and secondary ion-radical pairs in PS 1 and 2 are determined. Using femtosecond laser spectroscopy with a time resolution of 20 fs, it is shown that the primary charge separation in PS 1 occurs at a record high speed, shorter than 100 fs. Based on electrostatic and quantum-mechanical calculations, as well as the structure and dielectric properties of the protein, the redox potentials of all electron transfer cofactors in PS 1 are determined. Using the MSU supercomputer, a molecular dynamics model of PS 1 in a neutral state and in a state with separated charges has been constructed. The energy of the reorganization of the primary processes of electron transfer is determined.
-будет исследовано влияние температуры и осмолитов на перенос зарядов в электрон-транспортной цепи фотосистемы 1. -будут исследованы кинетики первичных стадий переноса зарядов в реакционных центрах первого и второго типа с помощью фемтосекундной лазерной спектроскопии методом возбуждение-зондирование при низкой температуре в субнаносекундном временном диапазоне. -будет изучено взаимодействия комплексов фотосистем 1 и 2 с экзогенными донорами и акцепторами электронов -будут определены кинетики и спектры первичной и вторичной ион-радикальных пар в ФС 1 и 2. -на основании электростатических и квантово-механических расчетов, а также структуры и диэлектрических свойств белка будут определены редокс-потенциалы всех кофакторов переноса электронов в ФС 1. -будет построена атомная молекулярно-динамическая модель ФС 1 и определение энергии реорганизации первичных процессов переноса электрона.
Электрометрический метод и методы импульсной абсорбционной спектрометрии1. Разработан прямой электрометрический метод, позволивший изучить кинетику, природу и молекулярные механизмы электрогенных реакций, сопровождающих перенос электронов от пластоцианина к терминальному железо-серному кластеру FB в фотосинтетических реакционных центрах ФС 1 (см. обзор (Semenov et al. 2006)) и от комплекса окисления воды ко вторичному хинонному акцептору QB в ФС 2 (Semenov et al. 2008).2. С помощью фемтосекундной лазерной абсорбционной спектрометрии методом «возбуждение-зондирование» исследована кинетика первичного разделения зарядов в комплексах ФС 1 из цианобактерий. 3. С помощью фемтосекундной спектроскопии выявлены кинетика и природа первичных стадий разделения зарядов в комплексах ФС 2 (Shelaev et al. 2008, 2011; Nadtochenko et al. 2014)4. С помощью импульсной абсорбционной и ЭПР-спектроскопии во временном диапазоне от 100 мкс до 1 с исследовано влияние высушивания в трегалозной стекловидной матрице на кинетику рекомбинации зарядов в комплексах ФС 1 цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 (Malferrari et al. 2016).Компьютерное моделирование1. Молекулярная динамика (МД), семи-континуальные электростатические и квантово-химические расчеты были использованы для моделирования молекулярных механизмов первичных стадий разделения зарядов в комплексах ФС 1 из цианобактерии Thermosynechococcus elongatus. На основании МД была построена карта подвижности атомов в белке ФС 1, которая показала наличие жесткого гидрофобного ядра и более подвижных периферических участков. 2. С помощью МД подхода был проанализирован отклик белка на первичные стадии переноса заряда в БРЦ. На основании рассчитанной спектральной функции поляризации БРЦ был определен диэлектрический отклик белка для реакций заряжения акцепторов в активной цепи переноса электрона, который был аппроксимирован системой ланжевеновских осцилляторов.
Комплексы фотосистемы 1 (ФС 1), выделенные из цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803, были иммобилизованы в высушенной стекловидной матрице дисахарида трегалозы (в присутствии аскорбата натрия и 2,6 дихлорфенолиндофенола в качестве редокс-медиаторов) в герметично закрытых эксикаторах в присутствии солей хлорида лития, карбоната калия, бихромата натрия и хлорида натрия, обеспечивающих парциальное давление водяных паров в эксикаторе на уровнях 11%, 43%, 53% и 75%, соответственно. Кинетика рекомбинации зарядов в этих системах измерялась с помощью импульсной спектрометрии с микросекундным разрешением на длине волны 700 нм. Спектральные изменения на этой длине волны отражают редокс-переходы Р700+/P700. Сопоставление кинетических параметров рекомбинации Р700+ при разных температурах при различной влажности воздуха показало, что быстрая компонента рекомбинации практически не зависит от температуры при всех измеренных условиях. Характер температурной зависимости рекомбинации с железо-серных кластеров ФС1 изменялся при повышении влажности окружающего воздуха; при влажности 43% температурную зависимость проявляла только рекомбинация с терминальных железо-серных кластеров, в то время как при влажности 55% и 75% обе компоненты ускорялись в ~3 раза при повышении температуры с 5 до 35 °С. Было изучено влияние трегалозы на светозависимое образование разности электрических потенциалов (Δψ) природными замкнутыми липидными везикулами - хроматофорами (Хром) из несерных пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides. Для измерения светозависимого образования мембранного потенциала в хроматофорах были использованы два различных метода регистрации Δψ – (1) классический прямой электрометрический метод и (2) метод измерения Δψ с использованием двух полупроводниковых электродов и зажатого между ними мембранного пористого фильтра. В обоих случаях максимальная амплитуда Δψ была получена в присутствии экзогенных редокс-медиаторов - пары аскорбат/N,N,N’N’-тетраметил-п-фенилендиамин и убихинона UQ0, дисахарида трегалозы и (в случае ITO|Хром–МФ|ITO) ингибитора цитохромного bc1-комплекса – антимицина А. Таким образом, светоиндуцированный перенос электронов в РЦ был основным источником генерации Δψ в системе ITO|Хром–МФ|ITO. Стабильность сигнала при длительном освещении (>1 ч) была обусловлена сохранением конформации, оптимальной для функционирования интегральных белковых комплексов и стабилизацией липидных бислойных мембран в присутствии трегалозы. Сохранение ~70 % амплитуды исходной Δψ в системе ITO|Хром – МФ|ITO на 30-е сутки хранения при температуре 23◦С в темноте на воздухе достигалось после повторного внесения свежего буфера, содержащего редокс-медиаторы. Хотя стабилизация фотоэлектрических ответов при длительном стационарном освещении наблюдалась при использовании обоих методов регистрации Δψ, только в системе ITO|Хром–МФ|ITO светозависимая активность РЦ сохранялась в течение месяца при хранении в темноте при комнатной температуре в присутствии дисахарида трегалозы. Стабильные фотоэлектрические ответы, вероятно, связаны с сохранением интактности белков Хром внутри пор МФ. Стабилизирующее действие трегалозы может быть обусловлено влиянием этого биопротектора как на белки РЦ, так и на фосфолипидную бислойную мембрану. Полученные результаты расширяют современные представления об возможности использования полусинтетических структур на основе интактных фотосинтетических систем, способных преобразовывать солнечную энергию в электрохимическую форму.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
2 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: 4.1. Основная функция пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2 (ФС 2) – использовать энергию солнечного света для разделения зарядов, за которым следуют две существенные химические реакции: окисление воды и восстановление пластохинона. Эти реакции разделены в пространстве и происходят на центральной – фотохимической, акцепторной – пластохинонвосстанавливающий и донорной – водоокисляющий участках реакционного центра (РЦ) в тилакоидной мембране.Однако поиск новых веществ, способных более эффективно стабилизировать структуру и функциональное состояние комплексов ФС 2, несомненно, является важной и перспективной задачей. В отчетной период времени нами было изучено влияние уникального по своим физико-химическим характеристикам дисахарида трегалозы на изолированные комплексы ФС2. Показано, что трегалоза значительно стимулирует стационарную скорость выделения кислорода. Трегалоза также предотвращает инактивацию при длительном хранении образцов ФС2. Предположено, что в присутствии трегалозы в результате изменения гидратации комплекс ФС2 переходит в конформацию, более оптимальную для эффективного функционирования. Также было исследовано первичные процессы переноса электрона и энергии в пигмент-белковых комплексах фотосистемы 1 (ФС 1) из цианобактерий с помощью методом «памп-проб» в ответ на единичные вспышки лазера (25 фс) при 670, 700, и 720 нм. Было показано, что соотношение между числом возбужденного хлорофиллаа в антенне и фотосинтетическимреакционным центром зависит от спектральных характеристик действующего импульса. На комплексах РЦ ФС 1 продемонстрирован рекордно быстрый перенос электрона между первичным донором электронов Р700 и первичным акцептором А0 (<150 фс). В результате проделанной работы выявлены основные факторы, определяющие рекордную в живой природе скорость переноса электронов в ФC 1 и квантовый выход близкий к 100%. Эти факторы необходимо учитывать при конструировании относительно простых и стабильных искусственных фотосинтетических систем преобразования и аккумуляции солнечной энергии на основе принципов природного фотосинтеза. | ||
3 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: | ||
4 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: На препаратах ФС 1, высушенных на стеклянной подложке в присутствии трегалозы и уравновешенных при влажности 53% и 11% была исследована кинетика рекомбинации зарядов на длине волны 810 нм, обусловленная восстановлением фотоокисленного Р700+. Было показано, что при высокой влажности (54%) основные компоненты кинетики спада дельта А(810 нм) хорошо аппроксимируются двумя экспоненциальными составляющими с характерными временами ~20 и ~190 мс в соотношении 1:6. Эти компоненты обусловлены рекомбинацией зарядов между терминальными железо-серными центрами FA/FB- и Р700+. При понижении влажности до 11% наблюдалось существенное ускорение кинетики рекомбинации зарядов и могло быть описано экспоненциальными компонентами со временами жизни 8 и 120 мс в соотношении 2:1. При этом кинетика недостаточно удовлетворительно аппроксимировалась экспоненциальными составляющими и лучше описывалась степенным разложением со средними временами жизни 10 и 200 мс (соотношение 2:1), соответствующему «размазанному» распределению комплексов по скоростям рекомбинации. Известно, что при низкой температуре в комплексах ФС 1 блокируется перенос электронов на терминальные акцепторы FA/FB и существенно замедляется рекомбинация зарядов между FX и Р700+. При этом проявляется гетерогенность кинетики рекомбинации, связанная с эффектом «замораживания» различных конформационных состояний белка. Сходный эффект наблюдается и в присутствии трегалозы при низкой влажности. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что эффект высушивания ФС 1 в присутствии трегалозы является в какой-то степени аналогом эффекта понижения температуры, ограничивая подвижность белка и препятствуя переносу электрона как в ходе прямых, так и в ходе обратных реакций. В связи с этим выводом нами была предпринята попытка определить, влияет ли высушивание ФС 1 в присутствии трегалозы на кинетику первичных реакций переноса электрона в ФС 1. С этой целью комплексы ФС 1, высушенные на стеклянной пластинке в присутствии трегалозы (влажность 11%) были исследованы с помощью импульсной фемтосекундной спектрометрии с разрешением 20 фс. Было показано, что кинетика переноса электрона от восстановленного первичного акцептора электрона А0- на вторичный акцептор А1 имеет характерное время ~ 28 пс. Это характерное время практически не отличается от определенного нами ранее характерного времени этой реакции в комплексах ФС 1 в растворе. Можно заключить, что ограничение подвижности белка, обусловленное эффектом трегалозы, покрывающей снаружи белковую глобулу, не влияет на образование первичной Р700+А0- и вторичной Р700+А1- ион-радикальных пар в ФС 1. | ||
5 | 1 июля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: На предыдущем этапе НИР исследовалось поведение комплексов фотосистемы 1 (ФС1) в условиях ограниченной подвижности этого пигмент-белкового комплекса, вызванной высушиванием в стекловидной матрице дисахарида трегалозы. Было показано, что эффект трегалозы на перенос электрона сходен с эффектом охлаждения системы до температуры стеклования белка. Однако литературные данные о кинетике рекомбинации зарядов в ФС1 при низкой температуре крайне ограничены и были измерены только при нескольких выбранных температурах. Нами была изучена кинетика восстановления фотоокисленного первичного донора Р700 в комплексах ФС1, лишенных железо-серных кластеров Fx, Fa и Fb, выделенных из мутанта rubA цианобактерии Synechococcus sp. PCC 7002, в широком диапазоне температур от 20 до 290 К с шагом 10 К. В подобных комплексах прямой перенос электрона ограничивается вторичными акцепторами хинонами А1, что существенно упрощает анализ экспериментальных данных. Кинетика рекомбинации зарядов между восстановленным акцептором А1 и окисленным первичным донором электрона Р700 была измерена с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии путем регистрации индуцированных лазерными вспышками изменений поглощения на длине волны 820 нм. Кинетики были проанализированы с помощью программы CONTIN, позволившей выделить в них две основные компоненты, приписанные рекомбинации с хинонных акцепторов А1А и А1В в симметричных ветвях редокс-кофакторов A и B. Характерные средневзвешенные времена гетерогенных компонент рекомбинации были независимы от температуры ниже 150 K (25 и 400 мкс для ветвей В и А, соответственно) и ускорялись до 10 и 80 мкс при комнатной температуре. Энергии активации этих реакций в области 150-290 К составляли 19 и 13 кДж моль-1, соответственно. При охлаждении комплексов ниже температуры стеклования белка (170 К) соотношение между прямыми реакциями в двух ветвях существенно изменялось в пользу ветви А, что не может быть объяснено в рамках представлений об активационных реакциях переноса электрона. Электрон-фононное сопряжение переноса электронов в ФС1 было проанализировано в рамках квантовой неадиабатической многофононной теории. Электронное сопряжение и факторы Франка-Кондона для прямых и обратных реакций между P700 и A1A/A1B были оценены согласно классическим эмпирическим моделям (эмпирическое приближение Мозера-Даттона, модель PATHWAYS Бератана и соавт.) и квантовой неадиабатической многофононной теории. Квантовая модель аппроксимирует поляризацию белка двумя упругими фононными модами. Высокочастотный режим сильно сопряжен с переносом электрона (частота ~1000 см-1, энергия реорганизации ~0,7 эВ) и принимает на себя основную часть изменения энергии. Низкочастотная мода слабо сопряжена с переносом электрона (частота 160-240 см-1, энергия реорганизации 10-30 мэВ), обеспечивает точную регулировку уровней энергии в системе и объясняет слабые температурные зависимости реакций переноса электрона. Предложенная модель позволяет обосновать асимметрию первичного разделения заряда, проявляющуюся в существенном преобладании рекомбинации с хинона А1А при низких температурах. Было показано, что механизм переноса электрона при комнатной температуре существенно зависит от ядерного туннелирования. Диэлектрическое поведение комплексов ФС1 напоминает свойства кристаллических и стекловидных твердых тел и требует квантового рассмотрения во всем диапазоне температур. | ||
6 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: Светозависимое выделение кислорода при фотосинтезе – основополагающий природный процесс, однако молекулярный механизм разложения воды комплексами фотосистемы 2 (ФС 2) изучен недостаточно детально. Кроме того, комплекс окисления воды (КОВ) ФС 2 является наиболее лабильным участком во всей электрон-транспортной цепи фотосинтезирующих оксигенных организмов. Поэтому изучение влияния осмолитов на КОВ ФС 2 является важной и актуальной проблемой. С помощью импульсной спектрометрии на ядерных комплексах ФС 2 показано, что трегалоза оказывает стабилизирующее действие на КОВ. Поляриметрические и флуориметрические методы продемонстрировали, что трегалоза вдвое стимулирует стационарную скорость выделения кислорода, а также увеличивает относительную долю реакционных центров ФС 2, способных окислять QA–. С помощью прямого электрометрического метода показано, что трегалоза не влияет на кинетику электрогенного переноса электрона от Mn на редокс-активный радикал тирозина Yz• (переход S1→S2), но заметно ускоряет кинетику выброса протонов вблизи марганцевого кластера при S2 → S3 и S4 → S0 переходах КОВ. Была исследована кинетика редокс-переходов первичного донора электрона ФС 2 – димера хлорофилла Р680 в высушенных стекловидных трегалозных матрицах путем регистрации изменений поглощения на длине волны 830 нм. Показано, что, по сравнению с раствором, наблюдается частичное блокирование прямой реакции переноса электрона между тирозином Yz и P680+ (~10 мкс), и появление медленной компоненты с характерными временами 100-150 мкс, вероятно обусловленной обратным переносом электрона от восстановленного первичного хинонного акцептора QA- на P680+. С помощью полярографии и флуорометрии было исследовано влияние влияние другого осмолита - гетероциклической аминокислоты гидроксиэктоина (Ect-OH) - на препараты ФС 2 с активным КОВ и продемонстрировано, что стационарная скорость выделения кислорода в присутствии этого осмолита увеличивается приблизительно на 40%. Показано также, что Ect-OH ускоряет перенос электронов от экзогенных доноров к РЦ в препаратах ядерных комплексов ФС 2, лишенных марганцевого кластера. Предполагается, что Ect-OH может служить для этих препаратов искусственным донором электрона, который не взаимодействует напрямую ни с донорной, ни с акцепторной стороной РЦ. Методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) изучено влияние дисахаридов трегалозы и сахарозы на активность хлоропластов шпината при псевдоциклическом транспорте электронов (Н2О → ФС 2 → ФС 1 → О2). О фотохимической активности хлоропластов судили по кинетике редокс-превращений Р700 - первичного донора электрона в ФС 1. Генерацию транстилакоидной разности рН (∆pH) регистрировали с помощью парамагнитного зонда ТЕМПамин. Показано, что при хранении изолированных хлоропластов (4°С) они сначала теряют способность поддерживать к светозависимой генерации ∆pH, а затем у них падает фотохимическая активность ФС 2. Падение фотохимической активности хлоропластов и их способности генерировать ∆pH замедляются в присутствии 0,5 - 1,0 М трегалозы и, в меньшей степени, в присутствии сахарозы. Методом спиновых меток начато исследование влияния осмолитов на липидный матрикс, окружающий ФС 1 и ФС 2. В качестве индикаторов структурного состояния использовали водорастворимые и липидорастворимые спиновые зонды. Показано, что ФС 1 является более эффективным восстановителем водорастворимых радикалов, чем ФС 2. В то же время липидорастворимые зонды слабо восстанавливаются этими белками. Этот результат составляет методическую базу для решения важной задачи проекта – выяснения влияния осмолитов на структурное состояние липидного окружения ФС 1 и ФС 2. | ||
7 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: С помощью импульсной абсорбционной спектрометрии с субмикросекундным временным разрешением исследована кинетика рекомбинации зарядов в диапазоне температур (Т) от 4 К до 310 К в комплексах ФС 1, выделенных из цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Анализ кинетики рекомбинации зарядов в нативных комплексах ФС 1 (далее – комплексы Р700-FA/FB) в широком температурном диапазоне позволил выделить компоненты рекомбинации, соответствующие отдельным обратным реакциям переноса электрона от различных редокс-кофакторов на Р700+. Были определены кинетика и термодинамика различных реакций рекомбинации зарядов. Показано, что при Т>180 К в кинетике восстановления фотоокисленного Р700+ преобладает компонента рекомбинации с терминальных 4Fe-4S кластеров FA/FB, в то время как при Т<170 К большая часть электронов не достигает даже кластера FX и рекомбинирует преимущественно с филлохинонного акцептора А1. Кинетика реакций переноса электрона является безактивационной при T<170 К, что соответствует переходу исследуемой системы в стекловидное состояние. Было обнаружено, что при T>170 К рекомбинация зарядов от терминальных 4Fe-4S-кластеров FA/FB может происходить по двум различным путям, характеризующимся различными значениями энергии активации (Ea). Рекомбинация с кластеров FA/FB через кластер FX и филлохинонный акцептор А1А характеризуется Ea~290 мэВ и является преобладающей при Т>280 К, в то время, как рекомбинация с прямой реакцией между 4Fe-4S кластером FX- и Р700+ характеризуется Ea~20 мэВ и становится доминирующей в диапазоне температур от 200 до 270 К. Рекомбинация зарядов от кластера FX становится чрезвычайно гетерогенной при Т< 200 К. Кроме того, была исследована температурная зависимость кинетики рекомбинации зарядов в комплексах ФС 1, лишенных субъединицы PsaC и терминальных железо-серных кластеров FA/FB (называемых Р700-Fx-core комплексами). В целом температурные зависимости кинетик рекомбинации на Р700-FA/FB и Р700-Fx-core комплексах были сходны. При уменьшении температуры от 300 до 200 К наблюдалось замедление основной кинетической компоненты, соответствующей рекомбинации с FX, от 3 мс до ~10 мс с энергией активации порядка 100 мэВ. При понижении температуры от 200 до 150 К происходило резкое падение амплитуды и замедление кинетики этой компоненты до секундных времен. При дальнейшем понижении температуры кинетика компоненты рекомбинации от FX на Р700+ не менялась. При понижении температуры эта компонента становилась гетерогенной со средневзвешенным временем, меняющимся от 4 мс при Т=310 К до ~100 мс при Т<150 К. Гетерогенность кинетики резко увеличивалась при Т<250 К, что отражало иммобилизацию белка в различных конформационных состояниях, характеризующихся сильно различающимися характерными временами. Конформационная подвижность ФС 1 была изучена с помощью молекулярной динамики. Было обнаружено, что кластер FX может принимать одно из двух конформационных состояний, поворачиваясь на 30 градусов вокруг оси между атомами серы. Изменение ориентации FX относительно электрического поля, создаваемого окружающими атомами белка, приводит к изменениям электрического потенциала на атомах кластера, что может служить причиной изменений преимущественной локализации электронной плотности на атомах FX и его редокс-потенциала. Эти эффекты могут объяснять частичное прекращение прямого переноса электрона от филлохинонного акцептора А1 на FX и далее на FA/FB, а также возникновение существенной гетерогенности кинетики рекомбинации, наблюдаемое при температуре перехода системы белок/глицерин/вода в стекловидное состояние (170 – 200 К). | ||
8 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: Изучена кинетика ре-восстановления окисленного лазерной вспышкой первичного донора электронов P680 в пигмент-белковых комплексах фотосистемы 2 (ФС 2) в растворе и в стекловидных матрицах дисахарида трегалозы при различной относительной влажности. В растворе и в повторно растворенном стекле в кинетике восстановления P680+ преобладали две быстрые компоненты со временами жизни в диапазоне 2–7 мкс, что составляло >85% от суммарной амплитуды сигнала. Эти основные быстрые компоненты ре-восстановления P680+ были приписаны прямому переносу электронов от редокс-активного тирозина YZ к P680+. Минорные более медленные компоненты были обусловлены рекомбинацией заряда между фотовосстановленным первичным пластохинонным акцептором QA- и P680+ во фракции реакционных центров, которые утратили способность к переносу электрона от YZ к P680+. Включение комплексов ФС 2 в стекловидную трегалозную матрицу и последовательная дегидратация вызывали увеличение времени жизни всех кинетических фаз, сопровождающееся ростом амплитуд более медленных кинетических фаз за счет более быстрых фаз. При относительной влажности 63% относительный вклад быстрых компонент снижался до ~ 50%. Дальнейшая дегидратация трегалозной матрицы практически не влияла на время жизни и вклад кинетических компонент. Наблюдаемый эффект был объяснен снижением конформационной подвижности белкового домена ФС 2 между YZ и P680, что приводило к ингибированию переноса электронов от YZ к P680+ примерно в половине популяции комплексов ФС 2, а в остальной половине реакционных центров наблюдалась рекомбинация между QA- и P680+. Сопоставление результатов, полученных на ядерных комплексах ФС 2, с аналогичными результатами, полученными ранее на комплексах ФС 1 из цианобактерий и реакционных центрах пурпурных фотосинтезирующих бактерий показало, что ФС 2 связывает большее количество молекул воды по сравнению с ФС 1 и с бактериальными реакционными центрами, что согласуется с кристаллографическими данными этих пигмент-белковых комплексов. Тот факт, что комплексы ФС 2, высушенные в стекловидной трегалозной матрице, сохраняют значительное количество молекул воды даже при относительной влажности <10%, дает важную информацию о структурной и динамической организации белково-трегалозных стекловидных матриц и о механизмах биопротекторного действия трегалозы. Полученные результаты свидетельствуют в пользу так называемой «якорной модели» и опровергают модель «замещения воды» при высушивании белков в трегалозной матрице. | ||
9 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: Исследована кинетика первичных реакций переноса электрона в комплексах фотосистемы 1, содержащих длинноволновую форму хлорофилла - хлорофилл f. Показано, что молекулы хлорофилла f выполняют роль светособирающей антенны и не участвуют в переноса электрона в реакционных центрах. Проведено комплексное протеомное исследование биологического действия нейротоксичной небелковой аминокислоты β-N-метиламин-L-аланина (ВМАА) на клетки нитчатой диазотрофной цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120. Протеомный анализ позволил выявить, что ВМАА изменяет регуляцию • ключевого белка РII, ответственного за азотный и углеродный метаболизм, • белков, вовлеченных в формирование фотосистем 1, 2, АТФазы и цитохромов, • ферментов синтеза и метаболизма аминокислот, • регуляторных и транспортных белков, • белков-шаперонов • белков окислительного стресса и репарации ДНК Результаты исследования опубликованы в 2021 году виде статьи и доложены на конференциях. | ||
10 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: Изучена кинетика рекомбинации зарядов в комплексах фотосистемы 1 цианобактерий в растворе и в насыщенной трегалозной патоке в диапазоне температур от -10 до +30 градусов. Сравнение характера температурной зависимости обратной реакции переноса электрона в пересыщенном растворе дисахарида трегалозы с полученными ранее данными для аналогичной реакции в водном растворе и водно-глицериновой смеси показало, что трегалоза не препятствует прямому переносу электрона, но затрудняет взаимодействие комплекса с экзогенными акцепторами электрона. Данная работа будет продолжена и расширена на дегидратированные трегалозные матрицы. Изучено влияние интенсивности и спектрального состава возбуждающего света на кинетику рекомбинации зарядов в комплексах фотосистемы 1 цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Показано, что амплитуда сверхбыстрой микросекундной компоненты рекомбинации не зависит от интенсивности возбуждающего импульса и зависит от спектрального состава возбуждающего света. В дальнейшем на основе этих данных будут сделаны выводы о процессах возбуждения молекул хлорофилла в антенне фотосистемы 1. Разработан метод регистрации образования разности электрических потенциалов фотосинтетическими комплексами при стационарном освещении. Разработанная система состоит из мембранного пористого фильтра, пропитанного суспензией пигмент-белковых комплексов и зажатого между двумя полупроводниковыми стеклами. С помощью этого метода показано, что комплексы фотосистемы 1 при стационарном освещении способны генерировать разность электрических потенциалов в присутствии искусственных доноров и акцепторов электрона, а также дисахарида трегалозы в течение длительного времени при комнатной температуре. В течение 2022 года было продолжено изучение регуляторного действия метаболитов микроорганизмов на процесс фотосинтеза в клетках цианобактерий. Вторичные метаболиты бактерий - это регуляторные молекулы, которые действуют как «информационные химические сигналы» , контролирующие метаболические процессы в клетках микроорганизмов. Эти молекулы служат для коммуникации бактерий в микробных сообществах. Экологическая роль микроводорослей в биосфере как основных производителей органического вещества ставит их на центральное место в различных экосистемах. Фотосинтез является центральным процессом в клетках микроводорослей и подвергается воздействию различных биотических и абиотических факторов. Различные вторичные метаболиты бактерий оказывают заметное регуляторное влияние на фотосинтез в клетках микроводорослей. В опубликованных работах в отчетный период представлены экспериментальные результаты, демонстрирующие влияние нескольких типов широко распространенных метаболитов (летучих органических соединений, небелковых аминокислот и пептидов) на фотосинтетическую активность в клетках микроводорослей (цианобактерий и зеленых водорослей). Использование этих молекул в качестве гербицидов может иметь большое значение как для их практического применения, так и для фундаментальных исследований молекулярных механизмов фотосинтеза и его регуляции. Кроме того, в отчетный период было изучено и экспериментально продемонстрировано антибактериальное действие антимикробного пептида, несущего CRAC-мотивы, на клетки грампозитивных и грамнегативных бактерий, отличающихся строением клеточных мембран. | ||
11 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза |
Результаты этапа: Выделенные по стандартной методике комплексы фотосистемы 1 (ФС 1) из цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 в присутствии аскорбата натрия и 2,6 дихлорфенолиндофенола в качестве редокс-медиаторов были иммобилизованы в высушенной стекловидной матрице дисахарида трегалозы в герметично закрытых эксикаторах в присутствии солей хлорида лития, карбоната калия, бихромата натрия и хлорида натрия, обеспечивающих парциальное давление водяных паров в эксикаторе на уровнях 11%, 43%, 53% и 75%, соответственно. Продолжительность инкубации составила 34 дня, для достижения равновесной концентрации воды в матрице ФС1-трегалоза. Кинетика рекомбинации зарядов в этих системах измерялась с помощью импульсной спектрометрии с микросекундным разрешением на длине волны 700 нм. Спектральные изменения на этой длине волны отражают редокс-переходы Р700+/P700. Сопоставление кинетических параметров рекомбинации Р700+ при разных температурах при различной влажности воздуха показало, что быстрая компонента рекомбинации практически не зависит от температуры при всех измеренных условиях. Характер температурной зависимости рекомбинации с железо-серных кластеров ФС1 изменялся при повышении влажности окружающего воздуха; при влажности 43% температурную зависимость проявляла только рекомбинация с терминальных железо-серных кластеров, в то время как при влажности 55% и 75% обе компоненты ускорялись в ~3 раза при повышении температуры с 5 до 35 °С. Было изучено влияние трегалозы на светозависимое образование разности электрических потенциалов (Δψ) природными замкнутыми липидными везикулами - хроматофорами (Хром) из несерных пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides. Для измерения светозависимого образования мембранного потенциала в хроматофорах были использованы два различных метода регистрации Δψ – (1) классический прямой электрометрический метод и (2) метод измерения Δψ с использованием двух полупроводниковых электродов и зажатого между ними мембранного пористого фильтра. В обоих случаях максимальная амплитуда Δψ была получена в присутствии экзогенных редокс-медиаторов - пары аскорбат/N,N,N’N’-тетраметил-п-фенилендиамин и убихинона UQ0, дисахарида трегалозы и (в случае ITO|Хром–МФ|ITO) ингибитора цитохромного bc1-комплекса – антимицина А. Таким образом, светоиндуцированный перенос электронов в РЦ был основным источником генерации Δψ в системе ITO|Хром–МФ|ITO. Стабильность сигнала при длительном освещении (>1 ч) была обусловлена сохранением конформации, оптимальной для функционирования интегральных белковых комплексов и стабилизацией липидных бислойных мембран в присутствии трегалозы. Сохранение ~70 % амплитуды исходной Δψ в системе ITO|Хром – МФ|ITO на 30-е сутки хранения при температуре 23◦С в темноте на воздухе достигалось после повторного внесения свежего буфера, содержащего редокс-медиаторы. Хотя стабилизация фотоэлектрических ответов при длительном стационарном освещении наблюдалась при использовании обоих методов регистрации Δψ, только в системе ITO|Хром–МФ|ITO светозависимая активность РЦ сохранялась в течение месяца при хранении в темноте при комнатной температуре в присутствии дисахарида трегалозы. Стабильные фотоэлектрические ответы, вероятно, связаны с сохранением интактности белков Хром внутри пор МФ. Стабилизирующее действие трегалозы может быть обусловлено влиянием этого биопротектора как на белки РЦ, так и на фосфолипидную бислойную мембрану. Полученные результаты расширяют современные представления об возможности использования полусинтетических структур на основе интактных фотосинтетических систем, способных преобразовывать солнечную энергию в электрохимическую форму. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".