ИСТИНА

Одним из важнейших регуляторов деятельности сердца является парасимпатическая система. Помимо модуляции частоты и амплитуды сердечных сокращений, основной медиатор парасимпатической системы ацетилхолин способен оказывать кардиопротекторное действие в условиях острой ишемии миокарда (Rosenshtraukh et al, 1994). Не так давно были предложены способы использования защитных эффектов ацетилхолина в клинике, в случаях хронической ишемии миокарда (Castro et al, 2004; Zimerman et al, 2010). Реализация парасимпатических влияний на сердце обеспечивается метаботропными мускариновыми рецепторами, ассоциированными с G-белками. Из 5 типов М-рецепторов, обнаруженных в сердце, особенно выделяются мускариновые рецепторы третьего типа (М3-рецепторы), поскольку именно этот тип участвует в реализации кардиопротекторных эффектов (см. обзор Hang et al., 2013). Наличие, распространение, а также функциональная значимость М3-рецепторов в различных отделах сердца млекопитающих была показана при помощи электрофизиологических и молекулярно-биологических техник (Abramochkin et al., 2012; Абрамочкин и др., 2013; Тапилина и Абрамочкин, 2015). Кроме того представлены убедительные доказательства большего значения М3-рецепторов в сердце на ранних этапах онтогенеза по сравнению со взрослыми животными (Tapilina & Abramochkin, 2016). В то же время есть основания полагать, что М3-рецепторы могут играть определенную роль в развитии возрастных структурных и функциональных изменений в сердце при старении. Так, например, показано, что с возрастом изменяется уровень экспрессии генов рецепторов, а также каналов, которые могут быть вовлечены в реализацию каскада внутриклеточной сигнализации, запускаемого М3-рецепторами (Kaplan et.al, 2007; Tellez et al., 2011; Guo-Jun Xuet et al., 2013). Также показано защитное влияние мускариновых рецепторов 3-его типа в условиях ишемических повреждений сердечной ткани (Yang et al., 2005), при развитии патологической гипертрофии миокарда (Zhao et al., 2013), а также при возникновении желудочковых аритмий различного генеза (Liu et al., 2008). Многие из указанных выше заболеваний сердечнососудистой системы развиваются с возрастом и могут существенно влиять на качество жизни и здоровье людей пожилого возраста. Поскольку в современном обществе растет продолжительность жизни, а сердечнососудистые заболевания все еще являются основной причиной смерти людей в России (Вишневский и др.,2016), изучение регуляции работы сердца, а также изменений, возникающих в сердечнососудистой системе при старении, является весьма важной задачей современной физиологии. В связи с этим, целью нашего проекта является определение степени участия мускариновых рецепторов третьего типа в реализации холинэргических влияний в сердце при старении. Для достижения поставленной цели планируется применить несколько методик. Влияние активации М3-рецепторов на параметры биоэлектрической активности разных отделов сердца у животных разных возрастов планируется исследовать при помощи внутриклеточной регистрации электрической активности в препаратах миокарда стеклянными микроэлектродами. Также при помощи данной методики планируется оценить вклад различных звеньев внутриклеточного каскада активации М3-рецепторов в наблюдаемые эффекты избирательной активации М3-рецепторов у животных разных возрастов. Методом пэтч-кламп в конфигурации whole cell предполагается исследовать вероятное влияние избирательной активации М3-рецепторов на основные ионные токи, формирующие биоэлектрическую активность сердца, и по литературным данным изменяться в сердце при старении. Кроме того, методом полимеразой цепной реакции будет измерен уровень экспрессии генов мускариновых рецепторов третьего типа, а также различных каналов, транспортеров и внутриклеточных рецепторов, участвующих в реализации холинергических влияний в сердце у животных разных возрастных групп. Данная работа позволит оценить вклад мускариновых рецепторов третьего типа в реализацию холинергических влияний на электрическую активность сердца у животных разных возрастных групп. Кроме того, исследование поможет понять, какие элементы каскада внутриклеточной сигнализации М3-рецепторов изменяются при старении и какие ионные механизмы при этом запускаются, что открывает возможности для корректировки патологических изменений в сердце, возникающих при старении. Ранее подобной работы не проводилось.

One of the most important regulators of the heart is the parasympathetic system. In addition to modulating the frequency and amplitude of the heartbeats, the main mediator of the parasympathetic system acetylcholine (ACh) is able to provide cardioprotective action in conditions of acute myocardial ischemia (Rosenshtraukh et al, 1994). Recently, have been proposed methods for using the protective effects of acetylcholine in a clinic, in cases of chronic myocardial ischemia (Castro et al, 2004; Zimerman et al, 2010). The implementation of parasympathetic effects on heart is provided by metabotropic muscarinic receptors associated with G-proteins. Of the 5 types of M receptors found in the heart, the third type of muscarinic receptors (M3-receptors) is particularly prominent, since this type is involved in cardioprotective effects (see review by Hang et al., 2013). The presence, distribution, and functional significance of M3 receptors in various parts of the heart of mammals have been demonstrated using electrophysiological and molecular biological techniques (Abramochkin et al., 2012; Abramochkin et al., 2013; Tapilina and Abramochkin, 2015). In addition, convincing evidence of a higher M3-receptor value in the heart at early stages of ontogenesis compared with adult animals is presented (Tapilina & Abramochkin, 2016). At the same time, there is a reason to believe that M3-receptors can play a certain role in the development of age-related structural and functional changes in the heart during aging. For example, it has been shown that the level of expression of receptor genes as well as channels that can be involved in the implementation of the intracellular signaling cascade triggered by M3-receptors changes with age (Kaplan et al, 2007, Tellez et al., 2011, Guo-Jun Xuet et al., 2013). Also shown the protective effect of the third type of muscarinic receptors in conditions of ischemic cardiac tissue injury (Yang et al., 2005), in the development of pathological hypertrophy of the myocardium (Zhao et al., 2013), as well as in the occurrence of ventricular arrhythmias of various genesis (Liu et Al., 2008). Many of the above mentioned diseases of the cardiovascular system develop with age and can significantly affect the quality of life and health of older people. Since life expectancy is growing in modern society, and cardiovascular diseases are still the leading cause of death in Russia (Вишневский и др., 2016), the study of the regulation of heart function, as well as changes in the cardiovascular system during aging, is a very important task of modern physiology. In this regard, the purpose of our project is to determine the extent of involvement of the third type of muscarinic receptors in the implementation of cholinergic effects in the heart during aging. Several methods are planned to be used to achieve this goal. The effect of activation of M3-receptors on the parameters of bioelectrical activity of different parts of the heart in animals of different ages is planned to be investigated using intracellular recording of electrical activity in myocardial preparations by glass microelectrodes. Also, using this technique, it is planned to evaluate the contribution of various links of the intracellular cascade of activation of M3 receptors to the observed effects of selective activation of M3-receptors in animals of different ages. With the patch clamp method in the whole cell configuration, it is proposed to investigate the probable effect of selective activation of M3 receptors on L-type calcium current, since changes in this current, depending on age, are shown (see the review of Janczewski & Lakatta, 2010). In addition, the level of expression of the genes of muscarinic receptors of the third type, as well as various channels, transporters and intracellular receptors involved in the realization of cholinergic effects in the heart of animals of different age groups will be measured by method real-time polymerase chain reaction (qPCR). This work will allow to evaluate the contribution of the third type of muscarinic receptors to the realization of cholinergic effects on the electrical activity of the heart in animals of different age groups. In addition, the study will help to understand which elements of the cascade of intracellular signaling of M3 receptors change with aging and which ion mechanisms are then triggered, which opens up opportunities for correcting pathological changes in the heart arising during aging. Such work has never been carried out.

) В результате выполнения данного проекта будут получены данные о действии избирательной стимуляции М3-рецепторов на конфигурацию электрической активности у животных разных возрастных групп. Исследование будет проведено на изолированном препарате стенки правого предсердия и левого желудочка крысы. Избирательная активация М3-рецепторов будет достигаться одновременной аппликацией мускаринового агониста пилокарпина и блокаторов М1-рецепторов пирензипина и М2-рецепторов метоктрамина. Предполагается использовать крыс трех возрастных групп: 4-5 месяцев, 12-14 месяцев, и 24-26 месяцев. Основываясь на кривых роста и выживаемости, эти группы соответствуют примерно 15, 35 и 70 годам у людей (Turturro, 1999; Tellez et al., 2011). 2) Будут получены данные об участии рецепторов к инозитолтрифосфату (IP3-R) в реализации эффектов наблюдаемых при избирательной активации М3-рецепторов желудочкового и предсердного миокарда у животных разных возрастных групп. Оценить вклад IP3-R в наблюдаемые эффекты избирательной стимуляции М3-рецепторов позволит использование селективного блокатора этих рецепторов 2-APB. Полученные данные могут иметь важную практическую ценность, поскольку повышение количества IP3-R может облегчать индукцию желудочковых аритмий. 3) Будет исследовано влияние избирательной стимуляции М3-рецепторов на кальциевый ток L-типа. Эти эксперименты будут проведены на изолированных желудочковых и предсердных кардиомиоцитах, выделенных из сердца животных разных возрастных групп с применением методики фиксации потенциала. 4) Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени будут получены данные об уровне экспрессии генов М3 рецепторов, а также уровне экспрессии генов, вовлеченных в обеспечение кальциевого гомеостаза (таких как IP3-R, кальциевые каналы L-типа) и активирующихся при стимуляции М3-рецепторов. В данных экспериментах также планируется использовать препарата предсердного и желудочкового миокарда животных трех возрастных групп. Полученные данные дополнят и расширят сведения о реализации холинергической регуляции сердца. А также помогут лучше понять природу функциональных изменений в сердце при старении и определить степень участия в этих процессах мускариновых рецепторов третьего типа. Новые данные относительно парасимпатической регуляции миокарда посредством М3-рецепторов могут иметь важную практическую ценность, поскольку некоторые элементы каскада внутриклеточной сигнализации, запускаемого М3-рецепторами, являются перспективными мишенями для разработки новых лекарственных препаратов для терапии ишемической болезни сердца (Inagaki, Churchill, Mochly-Rosen, 2006), гипертрофии, сердечной недостаточности (Ferreira, Brum, Mochly-Rosen, 2011) и других болезней.

Проблема участия мускариновых рецепторов третьего типа в реализации парасимпатических влияний на миокард активно разрабатывается в лаборатории д.б.н. Абрамочкина Д.В. в течение последних лет, о чем можно судить по публикациям в ведущих российских и зарубежных научных журналах. Большая часть работ по данной тематике проделана руководителем представленного проекта Тапилиной С.В. Ниже приведены основные результаты проделанной работы: 1. Впервые было показано действие избирательной стимуляции М3-рецепторов на параметры электрической активности рабочего миокарда крысы (Абрамочкин et al., 2013, 2008). Активация М3-рецепторов приводит к уменьшению длительности ПД в предсердном и желудочковом миокарде мыши и крысы. 2. В пейсмекерном миокарде мыши активация мускариновых рецепторов третьего типа приводит к замедлению автоматической активности (Abramochkin et al., 2012). 3. При помощи окраски мечеными антителами наличие М3-рецепторов показано как в рабочем, так и пеймекерном миокарде мыши (Abramochkin et al., 2012). Плотность М3-рецепторов оказалась существенно выше в области синоатриального узла относительно предсердного рабочего миокарда. 4. Данные электрофизиологических экспериментов также подтвердились молекулярно-биологичекими исследованиями. Методом ПЦР в реальном времени было показано наличие мРНК М3-рецепторов во всех отделах сердца мыши и крысы. 5. Было исследовано действие избирательной активации М3-рецепторов на миокард новорожденных и трехнедельных крысят. Миокард новорожденных животных почти в 3 раза более чувствителен к М3-стимуляции, чем миокард взрослых животных. Что было подтверждено методом ПЦР (показано увеличение уровня экспрессии гена М3-рецепторов в миокарде новорожденных животных в 5 раз относительно взрослых крыс (Tapilina and Abramochkin, 2016, 2015)). 6. Кроме того, руководитель проекта владеет методикой patch-clamp в конфигурации whole cell для регистрации ионных токов (Abramochkin et al., 2014).